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Small Methods | 南开大学化学学院刘定斌团队:一种基于刺激响应的外泌体高效富集方法

外泌体直径为30-150 nm,携带核酸、蛋白质等生物大分子,参与各种病理生理过程,存在于血液、尿液和唾液等体液中。近年来,外泌体越来越被认为是最有前途的“液体活检”生物标志物之一。然而,外泌体通常与各种难以分离的非囊泡物质(如可溶性蛋白和脂蛋白)共存于生物体液中,现有的方法很难将其有效分离,这种困境限制了外泌体研究领域的发展。因此,迫切需要开发一种高产率、高纯度的分离富集方法,可以从临床样本(如血浆)中选择性地提取出外泌体,并且能够保留外泌体的活性,用于下游检测分析。
近日,南开大学化学学院刘定斌课题组开发了一种基于刺激响应性聚合物捕获外泌体的方法,可以高效地从血浆中分离出外泌体,研究成果以“Stimuli-Mediated Specific Isolation of Exosomes from Blood Plasmafor High-Throughput Profiling of Cancer Biomarkers”为题发表在Small Methods上(2022, 6(2):e2101234)。该研究得到国家重点研发计划项目(no. 2019YFA0210100),国家自然科学基金项目(no. 21775075, no. 21977053),南开大学中央高校基本科研业务费专项资金(no. 2122018165)的资助。南开大学化学学院博士研究生刘雪卉为第一作者,南开大学人民医院许晨教授和南开大学化学学院刘定斌教授为共同通讯作者。
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研究者将热响应共聚物(P(NIPAM-co-NAS),简称PNN),借助链霉亲和素和DSPE-PEG-Biotin的连接,修饰到外泌体的磷脂双分子层上(PNN-Exos)。当温度高于低临界相变温度(31 oC)时,外泌体表面修饰的PNN则会从亲水状态转变为疏水状态,导致PNN-Exos自发聚集(图1)。接着通过低速离心便可以分离得到外泌体,并继续进行检测分析。
捕获
1. 热响应聚合物体系分离外泌体的示意图
与超速离心和试剂盒两种常用的外泌体分离方法相比,热响应聚合物分离体系(DSPE-PNN)在分离纯度和产率方面具有明显优势(图2)。从外泌体粒子数与蛋白量的比值可以看出,DSPE-PNN分离的血浆外泌体纯度分别比超速离心和试剂盒高15%和24%。同时,DSPE-PNN分离的血浆外泌体产率也是三种方法中最高的。重要的是,可以通过还原剂断开S-S,将PNN从外泌体表面去除,保留了外泌体的生物活性。这种热响应分离技术无需复杂的程序和先进的仪器就可以完成,从而大大提高了分离富集的效率,有利于进一步的分析检测。
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2. 超速离心、试剂盒和DSPE-PNN三种方法捕获血浆外泌体的比较
a.三种方法的相对纯度。b. 三种方法的相对产量。c. 细胞划痕愈合率。d. 细胞摄取率。
随后,作者从不同类型的癌症患者和健康对照参与者的血浆中提取出外泌体,进行高通量的癌症相关mRNA分析以用于癌症诊断和鉴别,展示了DSPE-PNN分离体系的临床实用性。结果表明,仅CD44、VEGF、TRPS1、hnRNPH1、CD24或EGFR 单个mRNA便可将泛癌与健康对照区分开来。而当CD44和VEGF组合成一个检测指标时,可进一步提高临床检测的准确性(AUC=0.990)(图3)。此外,特异组合的mRNA检测指标还可以实现不同癌症类型的区分。
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3. 热响应聚合物从不同类型的癌症患者和健康对照参与者的血浆中提取出外泌体进行mRNA检测的ROC曲线分析
这种简单高效的外泌体分离富集技术,为癌症标志物的筛选及检测提供了全新的工具。该体系易于与其他分析工具(例如ELISA、流式细胞仪和纳米耀斑)相结合,用于分析其他外泌体标志物,如蛋白质和microRNAs等。这种简单、高效、高纯度和高通量的分离体系为外泌体的基础和应用研究提供了全新的富集-检测一体化平台,将有效促进外泌体研究领域的发展。
 参考文献:
Stimuli-MediatedSpecific Isolation of Exosomes from Blood Plasma for High-Throughput Profilingof Cancer Biomarkers. Small Methods. 2022, 6(2):e2101234.doi: 10.1002/smtd.202101234.
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