生物钟控制着生理学的许多方面，但参与组织间细胞间通讯的细胞外囊泡(EVs)（包括外泌体）是否以昼夜节律模式进行调节仍未被描述。近日，发表在Science Advances杂志的一篇文章使用液相色谱-质谱法在昼夜同步的肌腱成纤维细胞中展示了小型EV中蛋白质的24小时节律性丰度。此外，富含RNA结合蛋白的小EV的释放在时间上与富含细胞骨架和基质蛋白的小EV分离，后者在光相结束时达到峰值。最后，针对外泌体生物发生途径中的蛋白质分选机制，并确定（通过敲除昼夜节律调节的flotillin-1）肌腱成纤维细胞小EV中的基质金属蛋白酶14丰度受flotillin-1调节。总之，该研究已经确定了肌腱成纤维细胞释放的小型EV的蛋白质组学时间特征，这支持了生物钟调节EV中参与细胞间串扰的蛋白质货物的观点。
在哺乳动物中，生物钟负责在关键的稳态过程中产生每日节律，以预测24小时内的环境变化，包括调节体温、睡眠活动、进食和新陈代谢。几乎所有外周组织都有一个自我维持的分子振荡器，可产生24小时周期性的组织特异性时钟控制输出。由时差、轮班工作、睡眠中断和衰老引起的外周昼夜节律失调与发病率和死亡率增加有关。外周组织昼夜节律的同步是通过非光传输因子或“zeitgebers”的组合来介导的，例如，进食时间或计划锻炼，并由来自中央时钟的内源信号稳定。然而，尚未研究细胞间和组织间外周生物钟传输的机制。了解这些机制将解释身体不同组织的昼夜节律是如何协调的。
负责产生24小时节律的主要分子振荡器是转录-翻译反馈回路，由以下转录因子组成：脑和肌肉芳烃受体核转运蛋白样1(BMAL1)和昼夜运动输出周期kaput(CLOCK)驱动时钟控制基因的表达，包括周期（PER）和隐花色素（CRY）。当细胞从组织中释放出来并置于组织培养中时，各个振荡器变得不同步，但可以很容易地重新同步，例如，通过施用糖皮质激素。同步细胞培养使人们能够发现生物钟如何在时间上协调细胞生物学的各个方面，例如，肌动蛋白动力学、内吞作用、分泌途径，以及最近的小鼠肌腱成纤维细胞分泌胶原蛋白、蛋白质折叠和内质网应激和自噬。生物钟是否也调节外泌体的生物发生，介导组织内和组织之间的细胞间通讯，尚未得到研究。
外泌体的蛋白质货物在内体途径中被装载；它们的通信方式包括将功能性货物（包括蛋白质和RNA材料）转移到受体细胞中。生物钟控制哺乳动物组织中近50%的蛋白质编码基因，因此，该研究假设细胞在24小时内释放的细胞外囊泡(EV)的蛋白质组是时间依赖性的。
在内体途径中对蛋白质进行分选的一个蛋白质家族是flotillins（flotillin-1和flotillin-2，分别由Flot1和Flot2编码），它们是定位于内体、溶酶体和外泌体的脂筏相关蛋白。Flotillins与货物蛋白上的双亮氨酸基序相互作用，以调节它们在特定膜隔室中的水平。Flot1在许多小鼠组织中的表达是昼夜节律的，包括肾、肝、肺和肌腱，这表明生物钟在时间上调节EV的蛋白质含量的机制，包括外泌体和其他内体隔间。
肌腱成纤维细胞在培养中保持其高合成活性和内源性昼夜节律，这使得它们与体外研究生物钟调节的细胞过程相关。肌腱必需的一种重要的膜定位蛋白是基质金属蛋白酶14（MMP14或MT1-MMP）。在肌腱和许多其他组织的发育过程中，MMP14在富含胶原蛋白的细胞外基质(ECM)的组装中起关键作用。这种跨膜蛋白在其细胞质结构域中包含一个二亮氨酸基序LLY573，并且在定位于外泌体时保持催化活性。在这些数据的基础上，进一步假设MMP14也定位于肌腱成纤维细胞EV，并且其在EV中的水平可以由flotillin-1调节。
该报道研究了生物钟在调节小型EV中蛋白质货物的作用。使用蛋白质组学方法来表征从同步肌腱成纤维细胞中分离的小型EV时间序列的蛋白质组谱，并探索这些有节奏的EV蛋白的功能富集。此外，通过靶向flotillin-1调节内体蛋白分选并检查对MMP14定位的影响。
用于蛋白质组学分析的时间序列成纤维细胞小EV分离
昼夜小EV蛋白的鉴定和相位特征
昼夜周期分析为成纤维细胞小型EV提供了蛋白质组学时间特征
总之，节律性基因表达和蛋白质丰度的昼夜节律调节间接导致小型EV中蛋白质的时间特异性负载。此外，内体途径中分选蛋白的昼夜节律控制表达直接介导外泌体中靶向货物蛋白的丰度。在肌腱细胞中，昼夜节律调节的小型EV协调ECM组装和重塑，在肌腱细胞生物学之外，这些发现揭示了外泌体和其他小型EV如何促进组织内和组织之间不同细胞之间的时间同步。
参考文献：
YeungCC, Dondelinger F, Schoof EM, Georg B, Lu Y, Zheng Z, Zhang J, Hannibal J,Fahrenkrug J, Kjaer M. Circadian regulation of protein cargo inextracellular vesicles. Sci Adv. 2022 Apr8;8(14):eabc9061. doi: 10.1126/sciadv.abc9061. Epub 2022 Apr 8. PMID: 35394844.
外泌体资讯网 Sci Adv：细胞外囊泡中蛋白质货物的昼夜节律调节
