已知各种细胞突起会产生细胞外囊泡。细胞在迁移过程中会产生回缩纤维(RF)和迁移体（migrasomes）。细胞迁移离开后，大量RF从细胞中脱落并留下。RF与细胞分离后的命运目前尚不清楚。
为了研究RF的命运，清华大学生命科学学院俞立教授团队近日在Cell Research杂志发表文章，通过活细胞成像观察了Tspan4过表达的L929细胞。在迁移过程中，RFs在细胞的后缘被拉出，并且很快在RFs的尖端或分支点上形成迁移体。在这个阶段，Tspan4信号沿RF均匀分布。最终，RF开始中断。在大多数情况下，远离细胞的RF部分首先破裂，这并不奇怪，因为这些RF部分形成得更早。有趣的是，在RF分解后，Tspan4信号沿RF占据的路径显示为大量小斑点。
回缩纤维(RF)的断裂
为了研究这些RF斑点的形态，作者进行了扫描电子显微镜(SEM)分析。在RF的远端，留下大量圆形的小细胞外囊泡；在许多情况下，这些囊泡像一串珠子一样连接在一起。
表达Tspan4-GFP的L929细胞的SEM分析
为了检查这些囊泡是否具有连续膜，作者进行了透射电子显微镜（TEM）。TEM显示这些囊泡确实具有连续的膜，因此它们是真正的囊泡而不是破裂的膜碎片。冷冻TEM分析可以更好地保留精细膜结构的形态，进一步证实RF斑点是小的细胞外囊泡。这些囊泡比迁移体小得多，大小从50nm到250nm不等。这些数据表明，当RF破裂时，它们会形成一种以前未报道过的细胞外囊泡。与迁移体类似，这些小的细胞外囊泡是迁移依赖性的。因此，作者将这些囊泡命名为“retractosomes（姑且翻译为回缩小体）”，以反映它们的RF和质膜起源。在低温TEM下经常观察到串珠结构。这表明，在断裂之前，RF经历了一个形态转变阶段，RF的部分凸出成小囊泡，可能形成回缩小体。
表达Tspan4-GFP的L929细胞的TEM分析
迁移体的形成是由富含四跨膜蛋白的大结构域的组装驱动的，而Tspan4的过表达可以显著增强迁移体和RF的形成。为了测试四跨膜蛋白是否也参与回缩小体的形成，作者在L929细胞中过表达了Tspan4-GFP。与迁移体类似，Tspan4-GFP富含于回缩小体。使用共振扫描模式的活细胞成像显示Tspan4在RF中断之前开始沿RF凝聚并富含斑点；这些斑点最终成为回缩小体。此外，Tspan4的过表达显著增强了迁移体和回缩小体的形成。这种对回缩小体的影响主要是由于增强的RF形成。在过表达Tspan4的细胞中，RF的总长度增加了2.68倍，然后分解成更多的回缩小体。
在共振扫描模式下获得的表达Tspan4-GFP的细胞的RF延时图像。箭头表示RF断裂以形成缩回体
接下来，作者研究了回缩小体的蛋白质组成。为了分离回缩小体，首先去除培养基并用PBS清洗细胞，从而去除大部分小细胞外囊泡(EV)。接下来，收集细胞并进行两步低速离心以去除细胞体和大碎片。通过使样品通过0.22-µm过滤器来去除迁移体。最后，为了收集回缩小体，进行高速离心。虽然这种分离方案产生了回缩小体和断裂RF的混合物，但回缩小体是由断裂产生的RFs，因此该样本的蛋白质组成应与回缩小体的蛋白质组成基本相同。通过电子显微镜检查样品，发现分离的回缩小体囊泡的大小从50nm到250nm不等。分离的retractosomes的形态和大小与培养细胞中的retractosomes非常相似。分离的回缩小体小于迁移体，但略大于小型EV。为了进一步检查回缩小体的纯度，使用针对各种迁移体和小型EV标记的抗体进行了蛋白质印迹分析。分离的回缩小体含有非常低水平的Tsg101、CD63和Syntenin-1蛋白，这是小型EV的三个公认标记物。因此，分离的回缩小体没有受到大量小型EV的污染。虽然分离的回缩小体包含迁移体标记，如Pigk、Eogt和PCCA、PCCA和在某种程度上Eogt，与迁移体部分相比，回缩小体部分的富集度往往较低。此外，迁移体部分中存在少量线粒体蛋白Tim23，这可能是由于基础水平的有丝分裂，这是一种迁移受损线粒体的迁移体依赖性机制，而在回缩体部分中无法检测到Tim23。
对纯化的小EV和回缩小体的直径进行量化；通过蛋白质印迹分析细胞体、纯化的迁移体、小型EV和回缩小体样品中标志性蛋白
接下来，作者对回缩小体进行质谱分析，发现回缩小体的蛋白质谱与细胞体的蛋白质谱显著不同：与细胞体相比，回缩小体中富集了1107种蛋白质，而回缩小体中缺乏1309种蛋白质。我们对分离的小型EV和迁移体进行了定量质谱分析发现，retractosomes的蛋白质组成与migrasomes具有显著相似性，但与小型EV的蛋白质组成非常不同。
细胞体、迁移体、小型EV和回缩小体蛋白质组成的主成分分析
在斑马鱼胚胎发育过程中，迁移体通过在空间受限的位置富集和释放趋化因子来调节器官发生。因此，作者测试了回缩小体是否也含有趋化因子。为此，使用了D2SC细胞，这是一种表达趋化因子Ccl2和Ccl9的树突细胞系。研究发现Ccl2和Ccl9都富含于迁移体。相反，一些但不是所有的回缩小体都含有这些趋化因子。作者此前报道了migrasomes含有mRNA，并且可以被SYTO14（一种核酸染料）染色。与migrasomes相比，retractosomes没有显示SYTO14信号。因此，retractosomes具有与migrasomes不同的货物组成。
D2SC细胞中内源性Ccl2的免疫染色，放大的图像显示了迁移体（顶部）和回缩体（底部）；用WGA488和SYTO14染色的L929细胞的代表性图像，放大的图像显示了迁移体（顶部）和回缩体（底部）。
纯化的migrasomes、retractosomes和小型EV的质量控制蛋白质印迹；基于总蛋白质量的小型EV与回体缩的比率
到目前为止，已经使用各种方法来分离小型EV。回缩小体和小型EV的相似大小可能会产生回缩小体和小型EV的混合群体。为了测试这种可能性，作者使用各种广泛使用的方法分离了小型EV，然后通过检查迁移体/回缩体标记Eogt和Pigk的存在来评估回缩体污染。作为对照，还检查了小型EV标记Alix和Syntenin-1。研究发现retractosomes没有显著污染按照广泛使用的方法制备的小EV部分。
从培养基中纯化的小型EV不含大量的缩回体
总之，该研究描述了回缩小体（retractosomes）的发现，这是一种由断裂的RF产生的小细胞外囊泡。回缩小体的生理功能仍有待确定。
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参考文献：
WangY, Gao S, Liu Y, Wang D, Liu B, Jiang D, Wong CCL, Chen Y, Yu L. Retractosomes:small extracellular vesicles generated from broken-off retraction fibers. CellRes. 2022 May 4. doi: 10.1038/s41422-022-00666-2. PMID: 35508505.
