基因组编辑技术已成为治疗不治之症的潜在治疗工具。特别是，成簇的规则间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas 系统的发现和单向导 RNA (sgRNA) 的设计已经彻底改变了基因组编辑的应用。然而，与基因编辑工具的蓬勃发展相比，递送技术的发展相对滞后，从而限制了基因组编辑的临床应用。为了克服这些限制，研究人员开发了各类新型纳米递送系统。细胞外囊泡(EV)作为“天然驯化”的内源性纳米载体，具有生物相容性好、免疫源性低、稳定性优良、克服各种生物屏障等优点，已成为最具潜力的药物递送载体之一。
近日，深圳市康宁医院梁宇杰博士、卢建平主任，深圳市第二人民医院段莉研究员和香港中文大学夏江教授合作撰写了题为“”的综述，发表在国际知名杂志Biomater Sci上(doi: 10.1039/d2bm00480a)，该文章从细胞外囊泡发生、内容物加载和靶向递送等方面概述了细胞外囊泡相关概念，并展现了基于细胞外囊泡的 CRISPR/Cas 递送方面取得的最新研究进展。研究者总结了工程化细胞外囊泡递送系统的最新改造方案，并讨论了靶向递送 CRISPR的应用前景。通过细胞外囊泡递送基因编辑工具提供一种安全、有效和靶向治疗的工具，有望在临床试验上实现基因组编辑和基因治疗突破性应用，必将造福全人类。
图文摘要：细胞外囊泡递送CRISPR/Cas9系统
文章要点：一、工程细胞外囊泡支架蛋白用于 CRISPR/Cas9 RNP 加载目前已发现多种跨膜蛋白和腔内蛋白在 EV 上特异性表达。其中一些称之为外泌体支架蛋白，可用于在EV生物发生过程中直接包装外源性蛋白。通过这些支架蛋白融合表达或相互作用方式，CRISPR/Cas9 RNP可以装载在EV表面或腔内。例如CD63 是EV膜表面高表达的四跨膜蛋白家族成员,其C端与 GFP 蛋白的融合表达可把GFP有效加载入外泌体腔内。为了提高 Cas9 蛋白在外泌体中的加载效率，可将 Cas9 蛋白与GFP 纳米抗体相融合。由于 GFP-GFP 纳米抗体的之间的高度亲和力，Cas9 蛋白可以被选择性地捕获并有效地加载到外泌体中（Biomater Sci,2020,8,2966-2976）。
图一：用于加载货物到 EV的不同支架蛋白及目前开发用于在EV中载入CRISPR/Cas9蛋白的方案
二、VSV-G 辅助型CRISPR/Cas9加载方案水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)在质膜微结构域出芽期间被整合到病毒包膜中，经常用于病毒假型化。VSV-G结构域也参与内体和外泌体的形成过程。有研究通过表达编码 VSV-G 融合蛋白的基因可实现有效的蛋白质负载。例如通过split GFP的荧光互补技术、药物诱导型FKBP12-rapamycin-FRB复合物及DmrA和DmrC结构域对CRISPR/Cas9的主动加载极大地提高了向靶细胞递送的效率，并减少了EV中蛋白的非特异性封装。（参考Dev cell, 2020, 55, 784-801.e789; Nat Commun, 2020, 11, 1334; Molecular therapy,2019 27:151-163.）
图二：利用 VSV-G 修饰的 EV 中能有效富集CRISPR/Cas9 核糖核蛋白复合物
三、 外泌体/脂质体杂交递送CRISPR/Cas 的质粒为了提高外泌体的负载能力和递送效率，可以通过混合外泌体和脂质体膜伪装的纳米囊泡。通过与脂质体孵育产生的混合外泌体是药物封装和体内递送 CRISPR-Cas9 系统的有效新策略。作者研发团队也利用此方案在软骨细胞上实现了特定的基因编辑（Theranostics 2022; 12(11):4866-4878.）该工作得到深圳市医疗三名工程项目(No. SZSM201612079)、广东省高水平临床重点专科（No.SZGSP013）、深圳市医学重点学科建设经费资助(No.SZXK042)、深港创新项目（SGDX20201103095800003）及香港特别行政区创新科技署粤港科技合作资助计划 (TCFS) 的部分资助。参考文献：Cell-derived extracellular vesicles for CRISPR/Cas9 delivery: engineering strategies for cargo packaging and loading. Biomaterials science, 10.1039/d2bm00480a. 29 Jun. 2022, doi:10.1039/d2bm00480a官网链接：https://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2022/BM/D2BM00480A
外泌体资讯网 【综述】Biomaterials science|细胞外囊泡递送CRISPR/Cas9基因编辑工具：内容物包装和装载的工程化策略
