细胞外囊泡(EV)是细胞分泌的脂质双层包裹的颗粒。这些细胞来源的天然EV (natural EV, nEV)可用作药物载体来递送药物。与胶束、脂质体、聚合物纳米颗粒相比，nEV作为天然的递送系统，具有低免疫原性。还可与受体细胞膜融合，避开溶酶体吞噬，将药物直接输送到细胞质中，从而显著提高蛋白、核酸药物的输送效率。此外，干细胞分泌的nEV携带有母体干细胞的蛋白、核酸，目前也被尝试用于组织修复和再生。nEV用于药物递送及组织修复再生的前景良好，但nEV的自然产率极低。为了获得足够数量的nEV，需要大量的细胞和较长的培养周期，导致高生产成本，进而影响相关临床转化。近年来研究发现，通过破坏细胞（如机械挤压、超声、冻融等处理），可获得纳米尺寸的，外观及结构类似于nEV的囊泡（cell-derived nanovesicles, CNV）。但CNV的产率是nEV的50-100倍，生产成本不到nEV的10%。作为nEV的廉价替代品，CNV在药物递送和再生医学中的作用也已得到证实。但一个基本问题尚未被确认，即CNV和nEV到底有多相似？现有研究仅仅证明两者都是纳米级的脂质双层封闭囊泡，都携带经典的EV蛋白标记物。但两者携带的蛋白、核酸有多相似，还未有相关研究。近日，宾汉姆顿大学万源和南京医科大学附属无锡人民医院毛文君课题组，在ELSEVIER旗下的学术期刊Extracellular Vesicle上发表文章，研究者基于高通量测序对两者的蛋白及小RNA（small RNA， smRNA）进行了比较（图1）。同过往研究结论一样，该研究证实nEV和CNV在大小并无显著区别，蛋白印迹也发现两者都携带经典EV蛋白标志物。一些参与免疫调节的蛋白，如CD55, CD44, CD5，MHC-I等，均在两者中检测到（图2）。nEV的排他性标志物，如细胞色素C，钙联结蛋白，组蛋白，在nEV中检测不到。挤压获得的CNV携带有微量细胞色素C，但未见钙联结蛋白和组蛋白。后续的蛋白质谱分析中也为发现钙联结蛋白和组蛋白。
图1 实验流程
图2 nEVs和CNVs特征蛋白质谱分析发现MDA-MB-231细胞来源的CNV和nEV，总蛋白（膜蛋白及包裹在囊泡内的蛋白）的近似度约21%（图3）。 需要提醒的是，在比较蛋白表达近似度时，一般认为~60%近似度即有高度相似性。nEV组内三个生物学重复样品之间的近似度分别为66%，而CNV的组内样品间近似度则有79%。接着课题组培养9个不同肿瘤细胞系，并分别收集了nEV和CNV。利用核酸标记的抗体结合二代测序技术，来定性定量检测181种囊泡膜蛋白。结果发现，181种膜蛋白在nEV与CNV之间的近似度有71%（图4）。
图3 nEVs和CNVs来源的蛋白质谱分析
图4 9个不同肿瘤细胞系来源的nEVs和CNVs囊泡膜蛋白检测二代测序比较了两组间smRNA的表达差异（图5）。单单比较smRNA种类，nEV和CNV近似度超过95%。接着对nEV和CNV中前1000个smRNAs表达量进行分析，发现这1000个smRNA在两组之间有65%的相似性。nEV组内五个生物学重复样品之间的批次间差异为5.4%，CNV组内批次间差异为9.3%。
图5 nEVs和CNVs间smRNA表达差异结合以上结果，研究人员推断当CNV用作药物载体时，其内部蛋白会被清空，被药物取代，但膜蛋白可被保留。基于CNV和nEV有高度近似的膜蛋白组分，CNV可能较好替代nEV用于载药。当CNV用于组织修复再生时，21%的总蛋白近似度及65%的smRNA近似度，也提示CNV具有可观的生物学活性。该研究结论大体证实了过往研究报道的的CNV可用于载药及组织修复再生。参考文献：Yi Wen#, Qin Fu#, Ashley Soliwoda, Sheng Zhang, Mingfeng Zheng, Wenjun Mao*, Yuan Wan*.Cell-derived nanovesicles prepared by membrane extrusion are good substitutes for natural extracellular vesicles.Extracellular Vesicle,Volume 1,2022,100004.（https://doi.org/10.1016/j.vesic.2022.100004）
