从患者样本中提取的细胞外囊泡(EV)的分离和随后的分子分析是了解囊泡生物学和促进生物标志物发现的一种广泛使用的策略。尿液中表达的前列腺分泌物是一种肿瘤近端液体，作为用于液体活检方案的潜在前列腺癌(PCa)生物标志物的来源，已受到广泛关注。标准EV分离方法，如差速超速离心(dUC)共同分离蛋白质污染物，这些污染物在典型的质谱(MS)协议中掩盖了低丰度蛋白质。使表达的前列腺分泌物的分析更加复杂的是，尿调节素，也称为Tamm-Horsfall蛋白(THP)，在尿液中以高浓度存在。THP可以形成聚合物，在纯化过程中捕获EV，从而降低产量。用二硫苏糖醇(DTT)破坏THP聚合物网络可以释放被困的EV，但在随后的超速离心过程中，较小的THP纤维会与EV共同分离。为了解决这些挑战，来自东弗吉尼亚医学院的Lifang Yang研究团队在JEV杂志发表文章，报道了一种dUC方法，该方法结合了THP聚合物还原和碱性洗涤，以去除THP和其他常见的蛋白质污染物、改善EV分离效果。
前列腺癌(PCa)是最常见的癌症。它表现出高度异质的临床表现，新诊断的病例从适合主动监测的固有惰性疾病到未经治疗会致命的侵袭性恶性肿瘤。因此，迫切需要开发生物标志物以准确量化新诊断或未治疗肿瘤的转移潜力。理想的生物标志物可以通过“液体活检”技术检测，该技术有助于对疾病状态进行微创或无创监测，以支持对患有高度惰性疾病的男性进行安全主动监测。监测前列腺特异性抗原(PSA)浓度被广泛用于此目的，但单独使用或与其他分子生物标志物联合使用时对PCa的特异性和敏感性不足。尿液中表达的前列腺分泌物（EPS-urine）为填补这一空白提供了一条有希望的途径。EPS-urine可以通过在临床标准直肠指检(DRE)后收集尿液来获得。这种液体富含前列腺衍生的蛋白质，是前列腺特异性生物标志物的现成来源。EPS-urine也富含来自前列腺和泌尿道的细胞外囊泡(EV)。这些小的膜封闭囊泡包括“外泌体”（~40-150nm），它们通过内体衍生的多泡体和其他类似大小的EV的表面融合释放，具体取决于所采用的分离技术。由于EV生物发生的机制，EV的分子成分受到母细胞分子成分的严重影响。重要的是，EV通过将包括核酸、脂质和蛋白质在内的生物活性货物分子转移到局部或远端部位的靶细胞来介导细胞内通讯。肿瘤衍生的EV通过与肿瘤微环境相互作用在肿瘤发生和进展中发挥作用。此外，双层膜的存在保护封闭的货物分子免受外源性核酸酶、蛋白酶和其他降解酶的影响，确保EV在包括尿液在内的不同体液中具有高稳定性。在最近的蛋白质组学研究中，已在这些囊泡中鉴定出数千种蛋白质。因此，来自PCa患者EPS-urine的尿细胞外囊泡(uEV)的蛋白质分析有望开发非侵入性PCa生物标志物，以帮助临床管理该疾病。虽然是蛋白质生物标志物的理想来源，但从尿液中分离EV存在着巨大的挑战。尿液具有较宽的离子浓度和pH范围、蛋白质丰度的动态幅度以及个体内部和个体间的高变异性。此外，大量尿调节素（也称为Tamm-Horsfall蛋白(THP)）的存在对uEV分离提出了独特的问题。THP通常是尿液中最丰富的蛋白质，每天分泌30-60毫克。它合成为GPI连接的膜糖蛋白，在细胞外蛋白水解切割后分泌到尿液中。分泌的THP单体聚集形成高分子量绳状细丝或电子显微镜可见的基质。这些THP矩阵可以捕获EV，使其无法进行分析，从而降低产量。其次，与其他污染性可溶性蛋白质一样，THP单体/寡聚体可以同时与EV一起沉淀和/或与EV结合，从而降低最终的uEV纯度。这两个因素共同影响了uEV的回收率，并降低了质谱(MS)分析对低丰度uEV蛋白的检测深度。已经采用了几种策略来最小化THP对uEV产率和纯度的影响。差速超速离心(dUC)是分离EV最广泛使用的方法。传统的dUC采用连续离心步骤，其中早期的“低速”（17,000-20,000g）离心去除较大的THP基质。然而，一部分uEV群体与THP矩阵共同分离，从而降低了回收率并引入了偏差。用还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理低速颗粒会使THP解聚并能够回收被困EV。不幸的是，在解聚过程中产生的较小的THP纤维是随后的“高速”（100,000-200,000g）离心步骤中潜在污染和与EV共沉淀的重要来源。该研究描述了一种改进的dUC方法，该方法采用碱洗来有效回收THP包埋的uEV，同时减少污染蛋白质。与现有的dUC方法相比，该方法显著提高了uEV的产率和纯度。作为新方法的生物学挑战，作者将该方法应用于来自PCa患者的EPS尿液样本，并使用MS描述了与PCa相关的uEVs蛋白质组。
差异超速离心(dUC)富集的EPS-尿细胞外囊泡的表征该方法应用于尿液中人类表达的前列腺分泌物时，该方法实现了已知前列腺和前列腺癌相关EV驻留蛋白的相对富集。该方法为尿液EV的总蛋白质组学分析提供了一种有前景的策略。
与uEV相关的高丰度尿蛋白、假定污染物和选定的ECM蛋白的相对去除
uEV中推定的EV标记蛋白和膜蛋白类别的相对富集
体内前列腺特异性和前列腺癌相关蛋白的相对富集
参考文献：Correll VL, Otto JJ, Risi CM, Main BP, Boutros PC, Kislinger T, Galkin VE, Nyalwidhe JO, Semmes OJ, Yang L. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 2022 Feb;11(2):e12184. doi: 10.1002/jev2.12184. PMID: 35119778.
外泌体资讯网 尿液细胞外囊泡提取时，如何减少尿中高丰度蛋白的污染？
