用于检测肺结核和肺外结核的灵敏和特异的基于血液的检测将降低与漏诊相关的死亡率，特别是在儿童中。近日，美国杜兰大学（Tulane University）胡晔教授在Nature Biomedical Engineering杂志上发表文章，报告了一种通过暗视野显微镜读取的纳米颗粒增强免疫测定法用于结核诊断，该测定法检测循环细胞外囊泡表面的两种结核分枝杆菌毒力因子（糖脂脂阿拉伯甘露聚糖及其载体蛋白）。在对147名住院和严重免疫抑制的HIV感染儿童进行的一项队列研究中，该检测检测出78例（74%）儿童结核病病例中的58例，微生物检测漏诊的66例（73%）病例中的48例，以及8/10(80%)例在研究期间未确诊。它还将结核病与非人类灵长类动物的潜伏性结核感染区分开来。作者还调整了该检测方法，使其可通过智能手机携带和操作。随着进一步的发展，该检测方法可能有助于在护理点检测结核病，特别是在资源有限的环境中。
结核病(Tuberculosis, TB)是传染病死亡的第二大原因，也是全球十大死因，估计每年有1000万新病例和120万例死亡。尽管全球为控制结核病做出了持续努力，但15岁以下儿童每年仍有约100万结核病病例和23万例结核病相关死亡。大多数儿童结核病死亡（80%）发生在5岁以下的儿童中，其中96%的死亡发生在因漏诊而未得到治疗的儿童中。COVID-19大流行阻碍了全球结核病控制工作，世界卫生组织(WHO)的模型数据表明，2020年在结核病流行国家观察到的结核病通知减少可能导致数十万额外的结核病死亡。大多数微生物结核病检测使用培养或核酸扩增来检测呼吸道和肺外样本中的结核分枝杆菌(Mtb)。然而，幼儿经常需要侵入性操作来获取可能含有少量Mtb杆菌（少杆菌TB）的呼吸道样本，并且经常出现呼吸采样策略遗漏的播散性或肺外TB。Mtb培养，诊断金标准，缓慢（2-8周），仅检测到30-62%的儿童TB。基于PCR的XpertMTB/RIF(Xpert)和XpertUltra可在数小时内提供诊断结果，但仅检测到Mtb培养检测到的Mtb阳性痰液(65%)和胃样本(73%)的一小部9。因此，Xpert和XpertUltra可能仅检测到所有儿童结核病病例的20%~40%，它们对HIV感染儿童的敏感性可能更低，因为他们的结核菌培养阴性率可能更高。此外，Xpert无法区分来自活和非活Mtb杆菌的DNA，从而降低了其在评估治疗反应方面的效用。此外，常规免疫分析显示出较差的诊断性能，因为Mtb衍生因子可能以低浓度循环，表现出较差的特异性或受到掩蔽效应的影响。此外，它们不能可靠地区分潜伏性结核感染和结核病。质谱联用免疫测定可以提高此类生物标志物的诊断性能，但由于设备和技术专业要求，这些方法的实用性可能受到限制。在许多研究和临床实验室中发现的通过暗视野显微镜(DMF)读取的纳米颗粒增强型EV免疫测定(NEI)可用于超灵敏检测血清中与癌症相关的细胞外囊泡(EV)生物标志物，但这些方法需要手动搜索以识别感兴趣的视野，使其容易出现操作员错误和偏见。该研究表明，通过利用Mtb膜上大量表达的因子，自动化NEI和机器学习可用于检测Mtb感染细胞(MtbEV)分泌的EV。本研究中使用的NEI靶向糖脂lipoarabinomannan(LAM)，它是分枝杆菌细胞壁的主要成分，占Mtb生物量的15%，可调节Mtb毒力，以及膜蛋白LprG。多项研究评估了尿液LAM检测对TB诊断的潜力，但很少有研究检测血清或血浆LAM检测，而且似乎没有一项检测检测血清或尿液LprG检测对结核病的诊断潜力。作者假设EV LAM和LprG表达可能作为肺和肺外TB的血清生物标志物，因为EV在血清中积累并且可以携带源自Mtb感染的巨噬细胞的因子（图1a）。因此，作者使用来自Mtb感染的巨噬细胞的EV证实了LAM和LprG的EV表面表达，研究了综合LAM和LprG标记在允许准确分类的非人类灵长类动物模型中区分活动性TB疾病和潜伏性TB感染的能力，并评估了这种综合生物标志物在有和没有HIV感染的儿科队列中诊断TB的能力，以解决HIV对TB诊断的影响。研究结果表明，NEI对肺结核和肺外结核以及对感染和未感染HIV的儿童的培养确诊和临床诊断的TB病例具有相似的诊断性能。
EV LAM和LprG 表达作为结核病诊断的生物标志物。基本原理和测定示意图。由Mtb感染的巨噬细胞释放的EV表达两种毒力因子LAM及其载体蛋白LprG，据报道它们以Toll样受体2(TLR2)依赖性方式调节免疫反应。这些EV可以进入循环系统，在结核病诊断中可能比细菌衍生的膜囊泡(BMV)更有用地指示Mtb发病机制，因为它们可能比BMV更不容易受到吞噬作用。这些宿主衍生的EV可以使用NEI方法轻松检测，该方法直接在抗体包被的测试载玻片上捕获血清EV，该载玻片富含表达宿主特异性蛋白CD81的EV，然后检测Mtb衍生的LAM的联合表达和通过暗视野显微镜观察EV表面的LprG生物标志物。该研究结果表明，直接捕获和分析血清EV以检测Mtb衍生的生物标志物特征可用于诊断TB，包括难以通过微生物检测和临床算法诊断的病例。NEI可用于诊断其他呼吸道疾病，包括分枝杆菌超家族的其他成员。需要进一步的研究来证实该结果并将其扩展到其他结核病队列，包括患有肺结核、肺外结核或HIV和结核合并感染的成年人。NEI工作流程可与酶联免疫吸附测定法相媲美，并且在经过独立优化和验证研究后，应该很容易适应临床应用。尽管血清EV携带适合诊断TB5的Mtb因子，但调节这些生物标志物差异表达的机制以及它们与疾病进展的关系尚不清楚，值得进一步研究。最后，并非队列中的所有儿童都可以获得纵向血清样本，从而阻止了广泛的治疗反应研究。尽管这项研究的重点是由宿主细胞分泌的EV携带的Mtb衍生因子，但这些EV上的宿主衍生因子可能包含额外的信息。作者计划探索评估Mtb和宿主衍生因素是否可以提高NEI诊断TB的敏感性和特异性。参考文献：Zheng W, LaCourse SM, Song B, Singh DK, Khanna M, Olivo J, Stern J, Escudero JN, Vergara C, Zhang F, Li S, Wang S, Cranmer LM, Huang Z, Bojanowski CM, Bao D, Njuguna I, Xiao Y, Wamalwa DC, Nguyen DT, Yang L, Maleche-Obimbo E, Nguyen N, Zhang L, Phan H, Fan J, Ning B, Li C, Lyon CJ, Graviss EA, John-Stewart G, Mitchell CD, Ramsay AJ, Kaushal D, Liang R, Pérez-Then E, Hu TY. Diagnosis of paediatric tuberculosis by optically detecting two virulence factors on extracellular vesicles in blood samples. Nat Biomed Eng. 2022 Aug;6(8):979-991. doi: 10.1038/s41551-022-00922-1. Epub 2022 Aug 19. PMID: 35986185.Using extracellular vesicles in blood to diagnose paediatric tuberculosis.Nat Biomed Eng. 2022 Aug;6(8):930-931. doi: 10.1038/s41551-022-00933-y. PMID: 35986180.
