关于细胞外囊泡的细胞生物学研究的最新进展突显了对获得3D细胞培养衍生EV的需求日益增加，因为它们被认为更准确地代表了体内获得的EV。然而，仍然迫切需要有效且可调节的方法来将EV从3D细胞培养物中分离出来。近日，JEV杂志上的一篇文章使用纳米原纤纤维素(NFC)支架作为3D细胞培养基质，开发了两种不同方法，用于从癌症球体中分离EV。
几十年来，细胞培养已被用作细胞生物学研究的主要策略，特别是在癌症领域，与传统的2D细胞培养相比，各种三维(3D)细胞培养系统已经出现，可以更好地模拟体内条件。通常，大多数细胞外囊泡(EV)研究都是在培养皿上以单层生长的细胞进行的，以促进从条件培养基中分离EV。然而，2D细胞培养缺乏细胞外基质(ECM)的影响，ECM已被证明可以动态影响多个细胞过程，例如增殖、存活和能量代谢。此外，由于2D细胞培养中的细胞形态，细胞极性可能会丢失，表型的多样性会减少，并且有限的细胞-细胞和细胞-基质接触不会促进环境生态位的形成。在3D细胞培养中，细胞可以像天然组织一样组织起来，甚至形成组织类型特征，例如上皮的腺泡结构或重要的癌症球体。
2D与3D（或生物反应器）中的培养条件会影响EV的生产，并且EV及其货物的产量均已被证明发生了改变。至关重要的是，与来自单层培养的EV相比，3D培养衍生的EV已被证明更类似于从患者身上获得的EV。目前，缺乏从3D细胞培养中获取EV的简单方法是一个瓶颈。使用超低粘附(ULA)板的无支架方法和从小鼠肉瘤中提取的生物支架（如Matrigel）提供了类似体内的ECM环境，已用于生长，例如3D癌症球体。此外，已经使用了由高含水量的交联聚合物材料组成的水凝胶支架，它们表现出类似于天然ECM的组织样刚度，但有利的是，它们不含动物源性分子成分。然而，许多3D支架和水凝胶的凝胶状结构难以溶解，这可能会妨碍有效收集EV和细胞以进行下游分析。因此，迫切需要用于EV生产和分离的新3D培养模型。
使用纳米纤维素可以获得一种新型的水凝胶。术语纳米纤维素涵盖一维范围为纳米的纤维素衍生材料。木材衍生的纳米原纤纤维素(NFC)由长度为几微米的长纳米级纤维组成，它在低浓度(0.1–0.2wt.%)下已经形成水凝胶。NFC表现出与生物3D支架相似的粘弹性、分子扩散以及与多种人类细胞系进行3D培养的生物相容性。重要的是，NFC中的球体形成已经被很好地表征为从ESC和iPSC到人类癌细胞系（如HepaRG、HepG2、MUG-Mel2和脐尿管癌）的不同细胞类型。正如Azoidis等人所详述的那样，嵌入0.2%NFC的间充质干细胞(MSC)形成了球状体，这些球体在整个水凝胶中均质且均匀分布，并且被发现具有同等的代谢活性并以与MSC生长的速率相等的速率增殖在2D中。在NFC中培养14天的未分化和分化HepaRG细胞培养过程中，显示出球体形成和球体直径增加。NFC可以用纤维素酶消化成可溶性葡萄糖，从而允许从培养物中回收细胞/球体。从EV的角度来看，缺乏可能污染生物支架的动物衍生分子和EV，以及水凝胶的高效消化，使NFC成为3D癌症球体衍生EV生产和分离的有前途的基质。
该研究介绍了一种基于NFC的快速pipeline，该pipeline由两种分离EV的方法组成，以实现不同的研究策略：1）终点在NFC消化后分离所有EV，以及2）用于球体生长过程中连续监测的EV分离。该方法适应不同的人类细胞系和EV分离方法。
从NFC培养的3D球体中分离EV的快速pipeline——分批和收获方法
批处理方法用于在培养期结束时提供高EV产量；培养过程收获的方法可实现依时间收集EV，以将EV分析与球体开发相结合。这两种方法都易于设置、快速执行，并且提供了高EV产量。与超低亲和力板上的无支架3D球体培养物相比，NFC方法产生了相似的EV生产，但NFC方法具有可扩展性且更易于执行，从而产生高EV产量。总之，该报道介绍了一种基于NFC的创新方案，用于从3D癌症球体中获取EV，可以对其进行定制以支持可变EV研究目标的需求。
外泌体资讯网 JEV：用于分离3D细胞培养物衍生细胞外囊泡的方法
