细胞外囊泡（EV）研究需要在单个囊泡水平上进行定量表征，才能更好揭示细胞外囊泡亚群的异质性和复杂性。但是目前，实现这一目的只能通过成像流式细胞术或芯片捕获后成像的单个EV分析，需要专用仪器和专有软件，不是每个实验室都能轻易获得。来自奥地利萨尔茨堡大学、德国哈根大学等研究人员基于标准共聚焦和广角荧光显微镜的受衍射极限限制的光斑检测原理，开发了一个ImageJ插件——“EVAnalyzer”，用于从成像数据中自动定量单个囊泡分析。这项以“EVAnalyzer: High content imaging for rigorous characterisation of single extracellular vesicles using standard laboratory equipment and a new open-source ImageJ/Fiji plugin”为题的论文于11月27日在J Extracell Vesicle期刊上发表。
细胞外囊泡（EV）在单个囊泡水平上具有复杂性和异质性。目前的研究表明，细胞不仅通过不同的生物发生途径分泌不同种类的囊泡，而且当放大到分子水平时，即使是来自同一类型细胞的特定的EV亚型，如外泌体，在单个囊泡水平上也有所差异。蛋白质机制如ESCRT复合体，控制了EV分子进入每个单独的囊泡。使用微流体技术捕获单个细胞，并结合全内反射荧光显微镜（TIRF）对免疫染色后的囊泡进行成像发现，即使是单个细胞，在相同的条件下，在短时间内，也会分泌大量不同的囊泡。这说明了在单个囊泡水平上定量信息的重要性。
单个囊泡可视化和定量的一种可能的解决方案是荧光显微镜。众多研究显示，通过亲脂性染料、荧光蛋白标记跨膜蛋白等方法可以在共聚焦显微镜上进行单囊泡检测，已越来越多地用于追踪细胞和体内模型中的单个EV，以及量化EV亚群。例如，有研究将EV在显微镜载片上的固定化，并通过免疫标记、高分辨显微镜后以及Imaris软件进行单个囊泡的可视化及图像分析。还有研究显示，聚丙烯酰胺凝胶包埋和免疫染色后的脂质染料标记EV的三维共聚焦成像。然而，目前仍需要对更多不同的样品进行系统验证和测试，如TIRF显微镜或单分子定位显微镜对单个囊泡进行深度表征和跨膜EV标志蛋白的分析。
专业公司也认识到EV行业单囊泡成像的潜力。基于芯片的EV捕获平台和基于荧光的四次跨膜蛋白抗体检测最近已经被商业化，例如NanoView或Oxford Nanoimaging。这些平台越来越多地用于EV研究，并有望对该领域产生影响，尽管它们通常需要集成仪器、软件和消耗品。由于大量的初始投资、运营成本和所需的专业知识，这些技术主要在高度专业化的EV实验室中实施，也不是所有学术机构都能获得，且社会创新的机会也有限。
该研究团队发现，使用标准的广角显微镜和普通的石英玻璃载玻片，也可以观察到单个EV。这表明，可以设计一种简单、廉价和可靠的方法，通过标准荧光显微镜对单个囊泡进行定量分析。事实证明，瓶颈不仅在于样本的制备，还在于使用免费软件对多个图像进行自动量化。在这项研究中，研究人员开发了“EVAnalyzer”工具，一个Fiji（Fiji即ImageJ软件）的插件，用于从大量成像数据中自动定量分析单个囊泡。使用该工具，研究人员建立了一套全面的方案，用于使用专用标准试剂、材料和设备对EV进行捕获、免疫标记和荧光成像。此外，该过程可应用于合成纳米颗粒，从而可以确定脂基纳米颗粒的siRNA封装效率和SiO2纳米颗粒的蛋白质负载。EVAnalyzer提供了在单个细胞-单个囊泡水平上自动量化细胞摄取的途径，从而实现高水平EV摄取分析和筛选。这项研究展示了EVAnalyzer可以通过一般可访问的工具对EV进行严格的特征描述。团队进一步将插件作为开源代码提供，希望EVAnalyzer不仅是一个直接影响的资源，而且成为EV和纳米颗粒研究社区的开放创新平台。
图：通过EVAnalyzer插件对合成纳米颗粒的可视化成像以及分析
参考文献：EVAnalyzer: High content imaging for rigorous characterisation of single extracellular vesicles using standard laboratory equipment and a new open-source ImageJ/Fiji plugin. J Extracell Vesicles. 2022 Dec;11(12):e12282.
