细胞外囊泡(EV)在生理条件和癌症等病理环境的细胞通讯中起着关键作用。新出现的证据表明，EV是分子货物（例如蛋白质和核酸）的活跃载体，也是生物标志物和靶标的重要来源。虽然最近对人体体液中EV相关DNA(EV-DNA)的研究产生了大量数据，但目前还没有对EV-DNA信息进行分类的数据库。为了填补这一空白，该报道手动整理了一个源自人类生物体液（液体活检）和体外研究的EV-DNA数据数据库，称为细胞外囊泡相关DNA数据库(EV-ADD)。该数据库包含经过验证的实验细节和从同行评审的已发表文献中提取的数据。可以轻松查询以搜索EV分离方法和表征、EV-DNA分离技术、质量验证、DNA片段大小、起始材料体积、基因名称和疾病背景。目前，该数据库包含代表23种疾病的样本，13种不同类型的EV分离技术应用于8种不同的人体体液（例如血液、唾液）。此外，EV-ADD包含代表整个基因组的EV-DNA数据，特别包括致癌基因，例如KRAS、EGFR、BRAF、MYC和线粒体DNA(mtDNA)。
细胞释放的细胞外物质，例如细胞外囊泡(EV)、蛋白质和核酸，现在被认为是正常生理和疾病状态中的重要介质。这些分子可以很容易地从羊水、腹水、胆汁、血液、母乳、脑脊液、胸腔积液、唾液、精液和尿液等生物体液中分离和纯化，使它们成为许多情况下作为生物标志物的重要候选物，包括细胞稳态、传染病、新生儿筛查，以及研究最多的：癌症。游离DNA(cfDNA)已从液体活检中鉴定和分离，并显示出筛查、检测和监测各种癌症的巨大潜力。这反映在FDA批准的越来越多的液体活检测试中。cfDNA在衰老、坏死、细胞死亡期间释放，最近出现了活跃分泌的证据。此外，研究表明DNA可以与EV相关联，这在液体活检生物标志物领域也引起了广泛关注。
EV是由几乎所有组织细胞发出的一组高度异质的纳米级磷脂双层膜实体。除了从起源组织中分离出来外，这些颗粒还会脱落，并且可以从各种组织和体液中以相对较高的纯度分离出来（https://www.exosomemed.com/11843.html）。它们通过携带分子货物（例如RNA、DNA、膜锚定蛋白和胞质蛋白、脂质以及囊泡内部和表面的代谢物）充当细胞和组织之间的信使。EV根据其来源、尺寸和成分分为大型/中型和小型结构。大/中型EV包括癌小体、凋亡小体、外球、迁移体和微泡，而小型EV包括外泌体（大外泌体，90-120nm和小外泌体，60-80nm）和小EV簇(sEVC)。随着该领域的进步，EV亚型列表不断增加，上面的列表并不详尽，但它提供了EV异质性的证据。最近，使用不对称流场流分馏(AF4)发现了名为“外泌颗粒（exomeres）”（尺寸<50nm）的独特纳米颗粒（https://www.exosomemed.com/4061.html ）。外泌体并不是唯一的小的非EV纳米粒子。最近，还发现了supermeres(https://www.exosomemed.com/9770.html )和chromtimeres。该文使用EV作为从细胞自然释放的任何纳米级粒子的通用术语。
EV可以在各种生理和病理条件下捕获生物分子并介导细胞间通讯。虽然大部分文献都集中在EV中的蛋白质和RNA货物，但许多研究报告了DNA的存在与EV的表面或内腔相关。第一份关于EV在人血浆中携带基因组DNA和线粒体DNA(mtDNA)的报告发表于2013年，随后另一份报告描述了外泌体中突变的KRAS和TP53DNA的存在癌症患者血清。从那时起，许多关于细胞培养和生物体液EV-DNA的报道，后者使EV-DNA成为液体活检的有希望的候选者。EV普遍存在于生物体液中，并且由于脂质包裹而携带完整DNA的大片段，从而防止DNase诱导的降解。这表明EV-DNA与cfDNA相比具有优势，因此EV-DNA和cfDNA分析的结合可以提高检测的灵敏度和特异性。EV-DNA正在许多应用中进行研究。最近的研究表明，从母体血浆中分离出的外泌体DNA可用于预测胎儿性别和恒河猴D(RHD)基因型。在癌症患者中，来自EV的生物活性DNA正在作为一种生物标志物进行研究，作为一种在液体活检中监测疾病和治疗反应的手段以及检测突变以区分癌症患者来自非癌症患者。数据表明，人血清衍生的EV中包含的DNA跨越整个基因组并反映了亲本肿瘤的突变状态。此外，研究已经证明了EV-DNA作为癌症生物标志物的效用。事实上，与来自血浆的肿瘤和cfDNA相比，针对常见热点突变（BRAF、EGFR和KRAS）的EV-DNA的下一代测序显示出更高的灵敏度。Fernando等人报道，血浆中超过93%的总cfDNA位于外泌体中。在另一项研究中，EV-DNA的ddPCR用于检测胰腺癌患者的KRAS突变拷贝优于cfDNA。此外，从早期胰腺癌血浆中分离出的EV表明，与血液的其他七种成分（红细胞、白细胞、血小板、凋亡小体、大型EV、可溶性蛋白和流出物/EV游离上清液）相比，小型EV中的KRAS突变体拷贝明显更高。最后，研究表明，低至0.2–1毫升的血浆即可用于检测EV-DNA中的热点突变。因此，EV-DNA是有前途的液体活检方法进行诊断、预后和监测许多癌症的治疗反应，以及疾病发展的实时评估。
EV-DNA的拓扑结构也在研究中，DNA包装和定位的真实性质尚不清楚。虽然早期的EV研究主要报告了EV腔内的EV-DNA，最近的研究发现EV-DNA主要存在于EV的表面，特别是在小型EV中，而内部DNA是主要是大型EV。使用高分辨率碘克沙醇密度分级，Lázaro-Ibáñez及其同事将小型EV分为高密度(HD)和低密度(LD)，发现大部分DNA与HD部分相关，这被认为是源自亚细胞器的非典型外泌体或非囊泡材料。HD组分还包含比LD组分更大的DNA片段。大多数EV-DNA是ssDNA还是dsDNA仍在争论中。建议使用原子力显微镜或特定酶处理来更精确地确定ssDNA与dsDNA的比率。此外，基因毒性药物治疗和抗生素可能会影响EV-DNA的排放。例如，体外研究表明，用抗生素（环丙沙星）处理的Jurkat和MiaPaCa细胞系在外泌体表面释放出染色体DNA和线粒体DNA。表面结合的染色体DNA和DNA结合蛋白（组蛋白H2A和H3）介导外泌体与细胞外基质蛋白（纤连蛋白）的粘附并与受体细胞表面结合。EV-DNA的拓扑结构与特定的EV起源、EV大小、EV命名法、DNA大小、DNA类型、组蛋白和DNA结合蛋白相关。因此，在EV分离和表征过程中考虑EV-DNA拓扑结构并保护EV表面DNA免受核酸酶的影响是在EV-DNA研究中获得准确结果的基础。最后，需要建立共识的方法以实现上述技术的标准化，以保证EV货物表征的可重复性，这在临床环境中尤为重要。
尽管人们对基于EV-DNA的液体活检越来越感兴趣，但从生物流体中提取的EV-DNA的功能意义在很大程度上是未知的。由于EV-DNA主要是细胞死亡机制的结果，它可能通过充当排出受损DNA的机制在维持生理止血方面发挥作用。研究表明，癌症EV可以通过货物转移对受体细胞产生影响。有报告显示DNA整合到受体细胞的基因组中。研究发现通过EV转移全长双链致癌H-RAS DNA，导致受体细胞行为发生变化。然而，EV的生物学作用仍在研究中。David Lyden研究组的一项开创性工作表明，源自胰腺癌细胞的外泌体在体内模型中诱导转移前生态位形成并促进肿瘤进展（https://www.exosomemed.com/96.html）。
基于EV的液体活检的潜力仍在探索中，EV相关的评论文章和实验数据的数量在多个科学领域都有所增加，尤其是在癌症生物学领域。与EV相关的miRNA、mRNA和蛋白质已经确定并被认为是作为生物标志物的有前途的候选者。因此，有多个EV数据库的开发，例如ExoCarta、Vesiclepedia、EVpedia和EV-TRACK，旨在统一和促进EV相关蛋白、RNA、脂质和代谢物的研究。相比之下，EV-DNA实验数据仍然埋藏在已发表的文献中。随着越来越多的数据在EV-DNA上生成，将可用数据集呈现为计算机可索引将变得更加迫切，以便快速跟踪并方便用户访问。目前，没有基于人工整理文献收集EV-DNA信息的在线资源。为了满足这一需求，该研究将所有当前公布的人类液体活检样本的EV-DNA数据汇编到一个公开的在线数据库中，该数据库名为细胞外囊泡-相关DNA数据库(EV-ADD)，它将作为人类生物体液的相关EV-DNA数据。该数据库补充了解决EV-DNA在体外情况中存在的研究。使用Web of Science和NCBI的PubMed系统收集数据，并在EV-DNA领域发表文献综述以确保充分和有效的覆盖范围，然后手动整理到EV-ADD中。目前，EV-ADD包括13种不同类型的EV分离技术和10多种DNA分离方法、5种EV-DNA定量分析、8种人体体液类型、23种疾病和健康对照数据。
EV-ADD的简化原理图工作流程
(A)EV-ADD中主要功能的概述。从人类生物体液中分离出的EV-DNA的已发布数据是在EV-ADD的基于Web的应用程序中手动整理和注释的，可以根据各种类别进行搜索和分类。(B)EV可以使用(C)各种EV纯化技术从人类生物流体中分离出来，然后(D)EV-DNA可以使用商业试剂盒或内部方法进行分离。(E)最后，可以使用各种PCR和测序技术检测EV-DNA突变、SNPs和CNVs。
EV-ADD是第一个汇总源自人类生物流体样本的所有可用EV-DNA数据集。该数据库为基于EV-DNA的液体活检研究提供了重要的参考资源，作为学习工具和展示EV-DNA领域的最新进展。随着新发布的EV-DNA数据可用，EV-ADD将每年更新一次，可在www.evdnadatabase.com免费获取。
参考文献：
Tsering T, Li M, Chen Y, Nadeau A, Laskaris A, Abdouh M, Bustamante P, Burnier JV. EV-ADD, a database for EV-associated DNA in human liquid biopsy samples. J Extracell Vesicles. 2022 Oct;11(10):e12270. doi: 10.1002/jev2.12270. PMID: 36271888; PMCID: PMC9587709.
外泌体资讯网 EV-ADD——细胞外囊泡相关DNA数据库
