免疫检查点抑制剂是目前常用的肿瘤免疫治疗药物，已被用于多种肿瘤的临床治疗，但由于存在尚未明确的因素，很多肿瘤患者对免疫检查点抑制剂的反应率较低，其生存率改善不明显。肿瘤细胞表达的免疫检查点分子PD-L1参与肿瘤免疫调节，是重要的免疫检查点抑制剂靶标。随着研究的进展，人们发现一些肿瘤细胞分泌的外泌体也可携带PD-L1并发挥特殊功能，这被认为可能是PD-L1/PD-1抑制剂在某些肿瘤治疗中反应率较低的重要原因。
近日，澳门科技大学于海杰助理教授课题组在国际细胞外囊泡学会（ISEV）官方期刊Journal of Extracellular Vesicles (Q1，IF：17.34)上发表了题为“Suppression of PD-L1 release from small extracellular vesicles promotes systemic anti-tumor immunity by targeting ORAI1 calcium channels”的研究论文 (https://doi.org/10.1002/jev2.12279)。研究团队发现ORAI1钙离子通道可以通过调控细胞内钙离子浓度，影响肿瘤细胞产生的携带有PD-L1免疫分子的细胞外囊泡（外泌体）分泌。在肿瘤动物模型中，敲低肿瘤细胞ORAI1通道可以抑制肿瘤细胞分泌PD-L1外泌体，增加脾脏中的CD8+细胞和肿瘤浸润的CD8+细胞，减缓肿瘤进展。
澳门科技大学埃尔文内尔博士生物物理与创新药物实验室于海杰助理教授和埃尔文内尔教授（1991年诺贝尔奖获得者）合作发现在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中，钙通道蛋白ORAI1能够通过控制细胞内钙离子浓度，调控MLPH和SLP2-a两个与胞内钙离子浓度相关的蛋白的功能，进而对PD-L1外泌体分泌产生影响。在肿瘤模型中，通过干预ORAI1通道功能抑制PD-L1外泌体分泌，可以引起脾脏和肿瘤浸润CD8+细胞增加，有利于控制肿瘤进展。
首先，作者发现在NSCLC细胞分泌的外泌体上含有PD-L1分子，并且外泌体PD-L1可被IFN-gama上调，同时IFN-gama也可以引起细胞内钙离子浓度上升。随后作者设计了一种能够实时观察PD-L1外泌体释放的荧光蛋白PD-L1_pHluorin，通过该荧光蛋白发现细胞内钙的上升能促进外泌体 PD-L1的释放。在非兴奋性细胞的钙内流途径中，钙通道蛋白ORAI1起着重要作用。作者将ORAI1敲低后NSCLC细胞增殖不受影响，全细胞的PD-L1蛋白含量没有发现明显变化，但外泌体PD-L1含量降低，释放减少。还发现敲低小鼠肺癌细胞的ORAI1也能抑制外泌体PD-L1分泌，并在小鼠肺癌模型中推迟了肿瘤进展，并伴随小鼠血清中外泌体PD-L1的降低和肿瘤抑制因子IL-2的增高，以及脾脏的增大。作者评估了脾脏T细胞群体的衰竭和激活标志物,在ORAI1敲低的小鼠中，表达衰竭标志物Tim-3的CD4+和CD8+ T细胞比例下降，而表达激活标记物颗粒酶B和增值标记物Ki67的CD8+T细胞百分比显著提高。此外，ORAI1敲低组动物肿瘤组织CD4+和CD8 T+细胞浸润增多。这些数据表明抑制肿瘤来源的外泌体PD-L1可以活化T细胞，特别是CD8 T+，从而抑制肿瘤生长。接下来，作者进一步探究了钙是如何调控外泌体PD-L1分泌。研究报导，Rab27能够调控细胞内囊泡转运，影响外泌体分泌，作者从Rab27效应蛋白中筛选出两个相关蛋白，MLPH和SLP2-a，与外泌体PD-L1分泌有关，且受到细胞内钙离子的影响。分别敲低这两种蛋白可以抑制NSCLC细胞外泌体 PD-L1的释放。进一步的实验证明，这两种蛋白的功能依赖不同的钙调方式，它们对NSCLC细胞运输和分泌外泌体发挥至关重要的作用。综上所述，该研究通过体内外实验证实ORAI1通过调节细胞内钙离子浓度影响NSCLC细胞分泌外泌体PD-L1，活化T细胞而重塑肿瘤免疫微环境。其中MLPH和SLP2-a两种蛋白在钙的调控作用中发挥重要作用。
该研究论文第一完成单位为澳门科技大学。澳门科技大学于海杰助理教授和德国马普实验室埃尔文内尔教授，以及刘良教授和黄锦伟教授为论文的共同通讯作者。澳门科技大学博士生陈曦为第一作者。这项工作得到了澳门科技发展基金和澳门科技大学校内基金的支持。
图1. ORAI1钙通道在调节肺癌细胞的外泌体 PD-L1释放和影响肿瘤免疫功能示意图
参考文献：
Suppression of PD-L1 release from small extracellular vesicles promotes systemic anti-tumor immunity by targeting ORAI1 calcium channels. Journal of Extracellular Vesicles (2022), 11:12279 https://doi.org/10.1002/jev2.12279
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