CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于各种由基因改变所致疾病的治疗当中。其通过人工设计的可靶向目标位点的sgRNA及受其引导的可进行DNA双链切割的Cas9蛋白以实现目标基因修饰。虽然CRISPR/Cas9系统在基因编辑上具有巨大潜力，但是低效率的递送方式是其在疾病治疗中的一大障碍。近年来，研究人员探索出可将细胞外囊泡作为CRISPR/Cas系统的递送载体。细胞外囊泡可由身体几乎所有类型细胞分泌，是细胞间交流的重要桥梁，其具有高生物相容性、低免疫原性、可通过血脑屏障等的优势，已被认为是可靠的药物递送载体，并在核酸、蛋白质、化学药物等递送中展现出较好的递送效率。近日，北京师范大学珠海校区梁雅轩副教授课题组受邀撰写了题为“New Therapeutics for Extracellular Vesicles: Delivering CRISPR for Cancer Treatment”的综述，发表在International Journal of Molecular Science杂志上(2022 Dec 12;23(24):15758)，该文章主要介绍了CRISPR系统的生物学特性和功能及递送该系统的常用载体，并总结了目前细胞外囊泡介导的CRISPR/Cas9系统基因编辑在不同癌症种类中的应用；文章进一步讨论了这一递送策略所面临的挑战。总之，细胞外囊泡介导的CRISPR/Cas9系统基因编辑将会对未来的癌症临床治疗提供重要治疗手段。课题组鄢碧莹同学为第一作者。该工作得到国家自然科学基金委和珠海校区科研启动经费的支持。
CRIPSR系统最初被发现于原核生物中，为原核生物提供适应性免疫来抵抗环境中外来DNA的入侵。外源DNA的第一次入侵都会被截取一部分（约20bp）插入到CRIPSR序列当中，当相同的外源DNA再一次入侵时，CRISPR序列转录产生pre-crRNA，反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）也同时转录，两者结合之后在RNA酶III（RNase III）剪切下得到成熟的crRNA复合体，该复合体与Cas核酸内切酶结合后，引导其对靶向位点进行DNA双链切割。该基因编辑系统应用到哺乳动物细胞时，研究人员设计将crRNA和tracrRNA结合，形成sgRNA执行功能。目前，显微注射、电穿孔、脂质体等物理和非病毒递送的方法以及AAV、慢病毒等病毒递送方式都已应用于该系统的递送中，但存在着装载率低、具有细胞毒性、体内抗体阻碍进一步治疗的问题，因此需要找到更为合适的递送载体。
图1 CRISPR系统通过RNA引导的Cas蛋白实现DNA双链切割细胞外囊泡（EVs）是可由身体各类型细胞分泌的纳米级大小的囊泡，其能够在体液循环中稳定存在，其可天然携带核酸、蛋白质、脂类、糖类等物质，是细胞间重要的沟通桥梁。目前，EV的生成过程具有两种主要途径。一种是通过细胞膜多次内陷产生的外泌体，另一种是通过细胞胞吐产生的微泡。不过，领域内学者普遍建议对于EV的命名，除非严格证明其生成途径，否则不建议直接命名为exosome外泌体或者microvesicle。ISEV建议根据分离出的囊泡大小或密度等物理性质对EV亚群进行命名，比如small EV（sEV）或者large EV（lEV）。目前，不同类型细胞产生的EV，如红细胞，免疫细胞等在癌症治疗当中展现出了较好的发展前景。
近些年，由EV介导的CRISPR/Cas9的基因编辑已在多种癌症中展开研究，如肝癌、卵巢癌、血癌等。EV对该系统的质粒、RNA以及核糖核蛋白的三种形式都可进行递送。除了使用传统的电穿孔、超声或者脂质体融合的方式装载外，研究人员更倾向于通过遗传手段进行外泌体装载，以提高该系统的包装效率，并得到装载有CRIPSR/Cas系统的内源性外泌体。总体来说具有两大策略，第一，通过已知蛋白的相互作用实现封装。如将GFP与外泌体表面富有的CD63蛋白融合，将Cas9蛋白和GFP的纳米抗体融合，通过GFP及其纳米抗体的相互作用将Cas9蛋白包装入外泌体中；第二，从外泌体蛋白分选的角度出发实现封装。如将Scr激酶N末端前导序列的八肽与Cas9蛋白融合，使该蛋白经过肉豆蔻酰化后被封装近外泌体中。虽然EV介导的CRISPR/Cas系统仍需要解决脱靶效应和封装效率低问题，但是相信其能够成为未来精准医学的有力工具。New Therapeutics for Extracellular Vesicles: Delivering CRISPR for Cancer Treatment. Int J Mol Sci.2022 Dec 12;23(24):15758. doi: 10.3390/ijms232415758.外泌体资讯网 Int J Mol Sci |北京师范大学珠海校区梁雅轩课题组：细胞外囊泡的新疗法：为癌症治疗提供CRISPR
