结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病过程隐匿，早期无明显临床症状，通常多数患者确诊时已发展到中晚期，五年生存率仅为20%左右。若能在高危人群中进行早期筛查，通过腺瘤摘除手术将大大提高病人的生存率（~90%）。然而，由于缺乏可靠的生物标志物，结直肠癌筛查仍以结直肠镜为金标准，其存在操作复杂、依从性差等问题，限制了大规模推广应用。因此，亟需发展简单、快速、有效的结直肠癌筛查方法。
近日，南开大学刘定斌、许晨团队发现粪便来源的细胞外囊泡（fEVs）可以作为结直肠癌无创诊断和预后的生物标志物。相关成果以“Identification of faecal extracellular vesicles as novel biomarkers for the non-invasive diagnosis and prognosis of colorectal cancer”为题发表在国际细胞外囊泡协会会刊Journal of Extracellular Vesicles（https://doi.org/10.1002/jev2.12300）上。南开大学化学学院博士研究生张兆伟、南开大学化学学院毕业博士刘雪卉（现就职于陆军军医大学）和天津医科大学第二医院杨小清博士是该论文的共同第一作者，刘定斌教授和许晨主任是论文的共同通讯作者。该项目获得国家重点研发计划和国家自然科学基金的资助。
在这项工作中，研究者从粪便样本中分离得到结直肠癌组织分泌的胞外囊泡，通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫蛋白印迹（Western Blot）证实了胞外囊泡的理化特征信息。接着，他们通过Western Blot证明了粪便中的胞外囊泡与结直肠癌组织的相关性（图1）。
图1 粪便来源的细胞外囊泡的分离与表征
随后，他们利用生物信息学结合Western Blot实验，在4例正常粪便样本和4例结直肠癌粪便样本中筛选出两个表达在fEV上的标志物——CD147和A33，通过免疫胶体金和免疫荧光实验考察了CD147和A33在fEVs和结直肠癌及癌旁组织中的表达（图2）。
为了进一步验证这两种标志物在结直肠癌诊断中的效能，他们构建并优化了酶联免疫吸附测定（ELISA）体系，考察了fEV-CD147和A33在16例正常粪便样本和48例结直肠癌粪便样本中的表达水平。实验结果显示，fEV-CD147和A33在正常组和结直肠癌组粪便样本中的表达水平具有显著性差异。ROC曲线分析表明，fEV-CD147和A33的AUC值分别达到0.904和0.903，二者组合的AUC值进一步提高到0.913，表明fEV-CD147和A33很有希望作为临床使用的结直肠癌标志物，用于结直肠癌的筛查、诊断和预后评估。同时，血浆中EV上的 CD147和A33在正常组和结直肠癌组的表达水平未检出显著性差异，这说明fEVs在结直肠癌诊断方面具有独特优势（图3）
图2 标志物的筛选与验证
图3 临床样本中CD147和A33的表达
为了考察fEV-CD147和A33在结直肠癌预后监测方面的效能，他们收集了手术后病人的粪便样本（29例）和术前-术后配对的纵向样本（7例）。实验结果表明，无论是群体还是个体，fEV-CD147和A33在术前和术后的表达水平均存在显著性差异，证实了这两种标志物在结直肠癌预后监测中的潜力（图4）。
图4 手术前后fEV-CD147和A33的表达
细胞外囊泡（EVs）继承了母细胞的分子信息，是液体活检中备受关注的癌症标志物。血液来源的EVs已广泛应用于癌症诊断和预后。血液具有全身循环的特点，因而血液来源的EVs包含了全身众多组织和器官的生物信息；而粪便与肠道有着特殊关联性，fEVs更特异地携带了结直肠肿瘤的生物信息。粪便通过自然的生理过程排出体外，为结直肠癌的无创诊断提供了便利。该研究表明，fEVs可以作为生物标志物，以非侵入性的方式用于结直肠癌的诊断和预后，具有巨大的临床应用价值。这一发现填补了fEVs与临床诊断之间的空白，将推进fEVs在结直肠癌基础研究和临床诊断中的应用。
通讯作者简介
刘定斌，国家海外人才计划入选者。2006年本科毕业于兰州大学，2012年博士毕业于国家纳米科学中心（师从蒋兴宇教授），随后在美国国立健康研究院（师从Shawn Chen教授）开展疾病检测研究；2014年加入南开大学化学学院，任研究员/教授、药物化学生物学国家重点实验室体外检测与分子影像研究室课题组长（PI）。近年来，已在包括PNAS、JACS、JEV、Angew. Chem.、Nano Lett.等国际著名期刊上发表生物检测和临床诊断相关论文90余篇，已获授权专利十余项，并实现了部分专利的成果转化。主持国家重点研发计划课题1项和多项国家自然科学基金；荣获中华医学会青年科技奖；担任国际医学杂志Nanotheranostics副主编/编委和《高等学校化学学报》青年编委。
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许晨，医学博士，主任医师，南开大学博士生导师，博士后合作导师，英国圣马克医院和皇家伦敦医院访问学者，国家自然科学基金评议专家。擅长痔、瘘、裂等肛门疾病的微创治疗；结直肠癌、家族性息肉病、炎性肠病等疾病的腹腔镜微创手术治疗；特别擅长低位直肠癌保肛手术，直肠前突、直肠脱垂、肛门失禁、盆底器官脱垂及各种复杂原因导致的便秘等盆底疾病的综合诊治。主持和参加国家自然科学基金项目3项，发表SCI论文10余篇。
外泌体资讯网 Journal of Extracellular Vesicles | 南开大学刘定斌、许晨团队:粪便中的细胞外囊泡：一种新型结直肠癌标志物
