细胞外囊泡（EVs）中的micro-RNAs (miRNAs)是一种非编码的内源性RNAs，可通过调控目标mRNA的表达来介导蛋白水平，在细胞的增殖转移、信号传导方面发挥着重要作用。与体液中循环的miRNAs相比，由于EVs膜的保护，囊泡内的miRNAs不易被RNA酶降解，相对更加稳定。且肿瘤细胞的EVs浓度明显高于正常细胞的EVs浓度，在肿瘤发展和转移中起着重要作用。近年来，大量方法被用于检测EVs中的miRNA。这些方法常常是在检测miRNA之前，先破坏EVs的膜结构，释放其内部的生物分子。这样被释放出来的生物分子或多或少会被外界干扰。因此，构建一种不破坏EVs膜结构同时对其内部分子进行原位检测的方法是非常必要的，这对于无创的疾病诊断同样具有重要的科学意义。
近日，齐鲁工业大学郭英姝团队通过构建一种EVs和红细胞膜囊泡(RVs)的融合策略，实现了EVs中miRNA-21的原位荧光检测。该成果以“In situ detection of miRNA-21 in MCF-7 cell-derived extracellular vesicles using the red blood cell membrane vesicle strategy”为题发表在 Chemical Communication期刊上（DOI:10.1039/d2cc05954a）。
红细胞内没有复杂的细胞器，降低了RVs的制备难度。另外，RVs表面的唾液酸可以靶向EVs表面过表达的唾液酸受体并与之结合，有望实现RVs与EVs融合。基于此启发，该论文中将DNA发夹探针包裹在RVs中，并且以膜融合的方式递送进MCF-7细胞分泌的EVs中，形成一个封闭的膜囊泡限域空间 (图1)。这种限域空间策略能够提高探针与靶标、探针与探针之间的碰撞几率，促进DNA自组装反应效率。
图1 利用膜融合策略原位检测EVs中miRNA-21的示意图
为了考察EVs与RVs的融合情况，该工作使用荧光显微镜观察了膜融合效果随孵育时间的变化。用两种不同染料分别对EV和RV染色，发现孵育2小时后，二者融合效果良好（图2）。
图2 RVs与EVs融合不同时间的荧光成像图
论文考察了不同浓度miRNA-21响应的荧光强度。实验结果表明，miRNA-21在50 pM-40 nM浓度范围内，与荧光强度之间存在良好的线性关系，线性方程为Y=11.94X+88.895 (Y:相对荧光强度;X: miRNA-21浓度，10-9M) (图3)。
同时，该论文还考察了受限空间中发生反应的效率。将EVs中miRNA-21和溶液中miRNA-21分别与相同浓度的探针反应，并记录80分钟内荧光强度的变化。实验结果表明，当反应被限制在EV的空间中时，具有明显的更快速杂交动力学(图3D)。
图3 （A）不同浓度miRNA-21的荧光光谱图。（B、C）不同浓度miRNA-21与相对荧光强度的拟合曲线。（D）EV中和溶液中miRNA-21的荧光强度随时间变化曲线
总之，该研究工作可以扩展到检测蛋白质、ATP等其他生物分子，为无创的疾病诊断及个性化医疗提供广泛的研究前景。
参考文献：
In situ detection of miRNA-21 in MCF-7 cell-derived extracellular vesicles using the red blood cell membrane vesicle strategy. Chem. Commun.. 2023, DOI: 10.1039/d2cc05954a.
外泌体资讯网 Chem. Commun|齐鲁工业大学郭英姝团队：利用红细胞膜囊泡策略原位检测MCF-7细胞来源的细胞外囊泡中的miRNA-21
