随着全球老龄化社会的进展，退变性疾病逐渐成为影响全球健康水平的首要因素。尽管病因各有不同，但退变性疾病具备一些类似的特性，包括局部稳态的失衡，慢性炎症的发展，局部组织活性的下降和干细胞功能的下降。细胞外囊泡（Extracellualar vesicle, EV）作为细胞分泌产生的异质性纳米尺度囊泡，能够通过递送核酸，蛋白质，脂质和糖等生物活性成分在退变性疾病中发挥治疗作用。EV因其本身具备的繁多功能为退变性疾病治疗提供了一个通用且高效的解决方案，但直接应用EV仍有一定的缺陷。对于全身给药的细胞外囊泡，由于本身缺乏靶向性的膜蛋白，容易被血管中的循环细胞摄取，清除率极高。而若是在病变部位直接局部注射，则容易流失，不易滞留，需要重复给药或增加给药量。近些年生物医学工程技术和材料科学的快速发展为克服这些缺陷提供了多种解决方案。
近期，上海交通大学医学院附属仁济医院脊柱外科的沈洪兴教授课题组发表综述，回顾了细胞囊泡工程化策略及其与生物医学工程技术结合的最新进展，并进一步总结了这类工程化细胞外囊泡在组织再生中的应用。相关内容以“Advances in extracellular vesicle functionalization strategies for tissue regeneration”为题在线发表在Bioactive Materials杂志上(2022 Aug 11;25:500-526)。
在此，研究人员阐述了目前常用于EV的工程化修饰改造策略。作者在第一部分首先针对EV的载药策略进行了总结。EV载药根据载药方式可分为被动载药和主动载药。直接孵育能够将疏水性药物以被动的方式装载入EV中，但载药率低和药物逸散快。主动载药可通过电穿孔、母细胞过表达以及母细胞工程化改造等方面将特定蛋白、核酸和小分子药物等装载入EV中，其载药率和稳定性都有明显提高。值得注意的是，EV作为纳米载药平台的核心优势均集中在其结构上面，因此载药过程对囊泡结构的影响是需要重点关注的。在具体操作过程中，载药方式选择仅仅与药物本身的属性相关，错误的载药方式不仅会导致载药率低，还可能破坏囊泡结构。
图1. 细胞外囊泡的内含物及其生物学功能
在综述第二部分，作者阐述了EV的工程化修饰（分泌前修饰和分泌后修饰）可为EV带来更强的功能，并扩宽其应用范围。分泌前修饰即通过对母细胞进行特定的修饰，将修饰内容被“继承”到其分泌的EV上。母细胞修饰方法包括简单的代谢修饰、细胞膜修饰和相对复杂的基因工程修饰。尽管操纵母细胞比直接修饰囊泡要简单许多，但由于囊泡产生过程，尤其是囊泡膜的形成和内容物的筛选过程目前仍有大量未知的环节，目前此类修饰方式仍属于“黑箱”修饰，修饰结果难以预测。和分泌前修饰相比，分泌后修饰具有机制简单，适用范围广等优点。目前主要的分泌后修饰手段分为物理修饰和化学修饰，有时候两种手段会合用或者和分泌前修饰合用。值得注意的是，由于EV接收机制的复杂性，若是膜表面的关键蛋白被修改或者囊泡本身结构被改变，可能会导致囊泡不被摄取甚至被无关细胞摄取，从而造成无法预估的副作用。因此，对细胞外囊泡的修饰方式应当谨慎。
图2. 细胞外囊泡的载药和修饰策略总结
在第三部分中，研究人员对生物材料辅助的细胞外囊泡疗法在退变性疾病治疗中的应用进行了总结。通过结合天然材料、人工合成材料以及经修饰的天然材料（如水凝胶、电纺丝、水凝胶微球等），EV在心血管系统疾病、骨相关疾病、伤口破损、神经损伤等中都能发挥良好的治疗效果，展现出了巨大的临床转化潜力。
图3. 生物材料辅助的细胞外囊泡疗法在组织再生中的应用
最后，研究人员也指出了EV进入临床所面临的挑战。首先，目前针对EV的表面修饰技术仍然过于繁琐，且EV损失极大，需要在阐明EV内吞发挥作用的机制的基础上，进一步开发具备普适性、简便性和高效性的表面修饰方法。第二，目前囊泡的载药率仍然是基于概率的，难以准确预测及测定，过量EV的体内注射可能会出现囊泡体内分布改变并导致窒息等副作用，因此进一步的载药技术改进和精确药物定量的方法是后续研究的重点，这能显著提高EV载药技术的安全性。第三，目前生物材料-细胞外囊泡使用的材料仍然主要局限于水凝胶材料，并且只发挥了单纯的递送作用。因此，后续的研究应当尝试探索更多智能化功能化的生物材料与EV的结合，以适应更加复杂的疾病微环境。第四，EV目前的产量仍然远远不能满足临床的需求。后续急需进一步的GMP技术改造研究，探讨如何批量稳定地产出均质的EV，这是EV迈向临床最大的困难。第五，目前EV的提取过程也仍然停留在实验级别的少量提纯，能够达到临床纯度的如超速离心法和差速离心法等均面临高成本、长耗时、低产率的问题。而在未来的工艺进步和器械改造下，以微流控技术和免疫磁珠法为代表的高精度，高通量提纯技术有望成为EV产业化生产的基础。第六，EV最后面临的技术门槛是质量控制，提纯过程中可能的微生物污染，外源血清以及异常囊泡的混入可能会导致致命的后果。在未来研究中，确立必要的纯度标准，并提出相应的技术指标和对应的质量评估系统能够保证后续研究的可重复性和稳定性，并为EV治疗的临床标准打下基础。
参考文献：
Advances in extracellular vesicle functionalization strategies for tissue regeneration. Bioactive Materials, 2023, 25: 500-526. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2022.07.022
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