Research｜山东大学李景新团队联合泌码科技：利用PBA技术首次解析结直肠癌患者血浆样本的单外泌体亚群构成

结直肠癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和致死人数在所有恶性肿瘤中高居第3位和第2位。不幸的是高达83%的结直肠癌患者在确诊时已是中晚期，因此结直肠癌的早期筛查和转移早期监测，对于提高结直肠癌患者疗效尤为必要。外泌体，是公认的液态活检生物标志物来源。单外泌体分析及外泌体溯源研究，是确定外泌体生物标志物的科学依据。

近期，山东大学基础医学院李景新教授团队、山东大学齐鲁医院郭炜博士、联合单外泌体技术开发者吴迪博士的Vesicode（瑞典）及泌码科技（深圳）研发团队，首次对结直肠癌患者血浆样本进行了单外泌体解析，建立了结直肠癌的单外泌体图谱，鉴定出分别具有促癌和抑癌作用的外泌体亚群，为结直肠癌早期诊断、转移预警以及外泌体疗法提出了全新的可能性。相关研究以“Single-Exosome Profiling Identifies ITGB3+ and ITGAM+ Exosome Subpopulations as Promising Early Diagnostic Biomarkers and Therapeutic Targets for Colorectal Cancer”为题发表在Research杂志上 （2023）Vol 6，0041（DOI: 10.34133/research.0041）。

项研究采用了邻近编码技术（proximity barcoding assay, PBA）用于血浆中混杂外泌体的解析，对样本中数十万个外泌体进行单个外泌体上260种膜蛋白定量检测，为外泌体溯源做了示范性的探索。结果发现随着结直肠癌的发生、发展和转移，患者血浆中的外泌体亚群构成展示了规律性变化。其中ITGB3阳性外泌体亚群随癌症发生和转移而逐渐上升，ITGAM阳性外泌体亚群则与癌症发生呈显著的负相关（图1）。

  图1. HC、Primary CRC和Metastatic CRC样本组组外泌体亚群t-SNE分布图

该研究证实了Ⅳ期结直肠癌患者来源的血浆外泌体能够促进结直肠癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力，也使得小鼠模型中CT26细胞向肺部的转移灶提高了3倍；通过进一步的细胞功能实验和小鼠荷瘤模型验证了ITGB3阳性外泌体在癌症发展中的促癌功能。文章发现SW480细胞系在ITGB3高表达后，其生产的外泌体亦高表达ITGB3，此类外泌体同样可以促进癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力；注射此类外泌体使得小鼠模型中结直肠癌CT26细胞的肺部转移能力提高了大约1.5-4倍不等（图2）。

图2. 肺转移肿瘤小鼠治疗示意图；每只小鼠肺转移肿瘤数量的直方图展示及苏木精和曙红染色的小鼠肺转移肿瘤展示图

此外，该研究证明健康对照特异性 ITGAM 阳性外泌体亚群的共表达蛋白均为单核细胞特征蛋白，可以溯源为免疫细胞来源外泌体。通过比较THP-1及其向M1和M2巨噬细胞转化后提取的外泌体，作者发现ITGAM蛋白主要来源于 M1 型巨噬细胞。健康人来源的血浆，M1巨噬细胞生产的外泌体均能够抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭迁移，注射此类外泌体，可以抑制小鼠皮下瘤模型中瘤体的增长。

 图3. 荷瘤小鼠治疗示意图；CT26肿瘤在第21天的图像、每只小鼠的肿瘤重量直方图展示

最后，外泌体ITGB3亚群作为结直肠癌生物标志物的诊断效能在发现队列（32人）、外部验证队列（88人）、独立的早癌样本队列（53人）中分别得以验证。研究表明结直肠特异性单外泌体亚群能够成为结直肠癌早期诊断的敏感可靠的生物学标记物。以ROC曲线线下面积（AUC）为依据，癌症诊断效能为AUC 0.868，转移预测效能为AUC 0.873，早癌筛查效能为AUC=0.835(图4)。

图4. 46种外泌体蛋白在CRC组和HC组之间差异表达的热图展示

综上所述，这项研究发现了对于结直肠癌有抑制作用的ITGAM阳性亚群和有促癌作用的ITGB3阳性亚群，并揭示了结直肠癌发生、发展和转移中外泌体作用的新机制，有望成为结直肠癌的早期诊断和转移预警的新型“肿瘤标志物”，为结直肠癌患者的诊断和治疗提供新的思路。另外，邻近编码技术PBA是实现单外泌体解析、构建单外泌体图谱的优势技术，为解决更多种重大疾病的生物标志物和治疗方案探索提供了新的技术手段。

参考文献：

Single-Exosome Profiling Identifies ITGB3+ and ITGAM+ Exosome Subpopulations as Promising Early Diagnostic Biomarkers and Therapeutic Targets for Colorectal Cancer, Research (Wash D C). 2023;6:0041. doi: 10.34133/research.0041.

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