细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）是细胞向胞外分泌的一种直径为30-2000 nm的磷脂双层囊泡，是细胞间通讯的重要媒介，在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，具有广阔的临床应用前景。然而，目前，越来越多的研究表明，EVs异质性显著，给EVs的精准监测与剖析带来了巨大的挑战。
近日，南方医科大学南方医院郑磊教授课题组与香港科技大学姚舒怀教授课题组合作在Chemical Engineering Journal杂志上发表了题为“ Profiling of single-vesicle surface proteins via droplet digital immuno-PCR for multi-subpopulation extracellular vesicles counting towards cancer diagnostics”的学术论文，报道了一种基于液滴数字免疫PCR（Droplet digital immuno-PCR, ddiPCR）的单囊泡膜蛋白表达谱分析技术，实现了特定EVs亚群的定量检测分析，在乳腺癌和肝癌的临床样本中进行了验证，可对患者与健康人进行良好区分，同时结合机器学习算法进行辅助分析，为EVs亚群检测辅助临床癌症诊断提供了新的检测策略。
基于微液滴的数字免疫PCR (ddiPCR)检测是免疫PCR和液滴数字PCR (ddPCR)的结合,兼具高特异性与高灵敏度的优势。在这项工作中，作者巧妙利用构建的抗体核酸复合物，通过抗体特异识别EVs上的特定蛋白质标志物并将蛋白质信息转换为核酸信息，通过核酸链触发基于不同浓度荧光探针构建的三重ddPCR体系，通过二维散点图中不同位置的荧光液滴团簇实现基于EVs三类蛋白质标志物的七类亚群定量分析。（图1）
图 1：多亚群ev计数的ddiPCR方法示意图
值得注意的是，这种基于微液滴的单囊泡包裹技术对EVs进行检测分析不会受EVs粒径的限制，Large EVs（lEVs, Size＞200 nm）和small EVs（sEVs, Size≤200 nm）均适用，可应用于特定EVs亚群的定量分析，具有良好的线性关系，如图2所示，R2达0.997，检测限<10 EVs/μL。在临床检测性能上，作者分别选取CD9/CD63/CD81、EpCAM、HER2蛋白标志物panel在乳腺癌队列（图3） (n = 100;健康对照33例，乳腺癌患者67例，其中I期24例，II期25例以及III期~IV期18例)上进行验证，同时作为一个普适性的方法，作者进一步改变标志物panel（CD9/CD63/CD81、EpCAM、GPC-3）在肝癌标本（n=55;健康对照23例，肝癌患者32例）中也进行了验证，均展现出良好的诊断性能，可对健康人和患者进行良好的区分。同时作者引入随机森林机器学习算法进行辅助分析，在CD9/CD63/CD81、EpCAM、HER2三类标志物的联合分析下，可区分健康人群与乳腺癌患者，AUC高达0.9427（图4）。
图2： ddiPCR方法的检测性能
图3：基于ddiPCR的不同sEVs亚群分析及其在乳腺癌中的应用研究
图4：随机森林机器学习算法辅助下基于不同sEV亚群组合的乳腺癌诊断性能分析
总结：
在这项研究中，作者开发了一种新的ddiPCR方法来定量分析单个EV上的多个表面蛋白标志物，进行特定EVs亚群的精准分析。通过同时检测单个EV的3种表面蛋白，实现了7个EV亚群的分类和定量。总的来说，该方法的优点总结如下: 1)它既具有ddPCR的单分子数字定量的优点，又具有ELISA抗原-抗体反应的高度特异性; 2)作为单EV水平的蛋白检测通用性平台，不受EVs形态和直径差异的影响，可以覆盖包括sEVs和lEVs在内的所有EVs; 3)操作过程简便、准确、可靠，可用于临床应用。进一步，ddiPCR与机器学习相结合可以进一步增强其在疾病诊断中的应用。后续有望扩展应用于EV蛋白生物标志物的筛选、癌症的早期诊断、治疗监测、预后评估和肿瘤复发预测等。
南方医科大学南方医院郑磊教授和香港科技大学姚舒怀教授为论文的共同通讯作者。南方医科大学南方医院刘春辰博士和林慧娴硕士为论文的共同第一作者。
参考文献：
Profiling of single-vesicle surface proteins via droplet digital immuno-PCR for multi-subpopulation extracellular vesicles counting towards cancer diagnostics, Chemical Engineering Journal, 2023,144364.
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.144364
外泌体资讯网 CHEM ENG J：基于液滴数字免疫PCR的单囊泡膜蛋白表达谱分析，实现细胞外囊泡多亚群计数并成功应用于癌症诊断
