细胞外囊泡（EVs）中的MicroRNAs （miRNAs）在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。EV miRNA的定量测量对于癌症诊断和纵向监测至关重要。然而，传统的基于PCR的方法需要多步骤的程序。来自美国麻省总医院的研究团队介绍了一种利用CRISPR/Cas13a传感系统的无扩增和无提取的EV miRNA检测方法。CRISPR/Cas13a传感组分被包裹在脂质体中，通过脂质体-EV融合将其递送到EV中，在卵巢癌细胞和患者血浆分析中显著完成了miR -21-5p阳性的EV的计数。该EV miRNA传感系统提供了无需RNA提取的完整EV特异性miRNA检测方法，为蛋白质和RNA标记的多重/单个EV分析开辟了可能性。相关内容以“CRISPR/Cas13a-Based MicroRNA Detection in Tumor-Derived Extracellular Vesicles” 为题于今年6月20日在线发表在国际知名综合性、跨学科学术期刊Advanced Science杂志上。
细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是一种纳米级的分泌颗粒，起源于细胞内体运输系统。EV含有分子货物，包括普通和细胞特异性蛋白质、核酸和脂质，反映了细胞起源的生理特征。这一特性使得EV作为循环生物标志物具有吸引力。在EV中包含的各种分子中，microRNAs （miRNAs）作为一组小的非编码RNA，通过抑制其靶RNA转录物的翻译和切割靶RNA参与转录后基因调控。miRNA通过EV介导的细胞间通讯参与许多生物过程，如细胞发育、细胞凋亡、细胞增殖、免疫反应和肿瘤发生。
很多研究已经证明了EV miRNA的不同作用。首先，miRNA参与疾病的发生和发展。因此，上调或下调的特异性miRNA可作为癌症、心血管疾病、肺病、神经退行性疾病等多种疾病的诊断标志物。其次，EV miRNA在细胞间通讯中起着至关重要的作用。例如，从THP1细胞衍生的EV中释放的淋巴细胞特异性miR-150被递送到人微血管内皮HMEC-1细胞中，通过调节c-Myb的表达来增强细胞迁移。因此，准确、定量地测量EV miRNA对于诊断性生物标志物的临床转化、更好地理解EV药物生物学过程至关重要。
EV miRNA的传统检测方法包括定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、northern blotting、微阵列和二代测序。虽然这些传统方法比较敏感，并提供目标miRNA的相对定量，但都需要多个步骤，包括EV裂解、RNA提取、DNase处理、cDNA合成和扩增。考虑到EV在几乎所有细胞中存在的不同EV亚型相关的高度异质性， EV裂解消除了单个EV中的细胞特异性信息，并通过来自非靶EV亚群的miRNA来稀释靶EV亚群中的miRNA。因此，在完整EV中检测靶miRNA的能力可以显著提高检测精度，并为研究不同EV亚型的RNA生物标志物铺平了新的道路。
为了解决技术挑战，研究团队的目标是开发一种新的完整EV miRNA检测技术。具体来说，研究团队实现了成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas系统，用于EV RNA检测。CRISPR技术广泛应用于基因组编辑、基因表达调控、生物传感等领域。近年来，基于CRISPR的诊断技术被开发用于即时检测SARS-CoV-2。在Cas核酸酶中，研究团队选择使用Cas13用CRISPR RNA （CrRNA）检测EV靶miRNA分子。靶RNA与CrRNA的直接杂交可激活Cas13a的核糖核酸酶（RNase）活性。激活的Cas13a切割CrRNA结合的靶RNA（顺式切割）和无边界单链RNA分子（反式切割）。后者可用于生物传感应用与荧光猝灭（fluorescence-quencher，FQ）探针连接单链RNA。这种方法避免了从RNA到cDNA的逆转录步骤，简化了EV miRNA的检测。
在这项研究中，研究人员报告了一种使用CRISPR/Cas13a的无扩增和无提取的EV miRNA检测方法。研究人员在脂质体中加入了CRISPR传感组分（包括Leptotrichia wadei菌来源的LwaCas13a、CrRNA和FQ探针），并通过EV -脂质体融合将其传递给EV。与脂质聚合物纳米颗粒、融合囊泡或脂质体的融合是在单个EV内递送传感材料的有效方法。这种策略提供了检测目标miRNA的机会，而无需复杂的RNA提取或扩增。
经过体外验证和检测优化，研究人员将该传感方法应用于检测不同卵巢癌细胞系EV中的miR-21-5p。miR-21-5p在卵巢癌组织、细胞及其上皮细胞中被发现过表达。该检测方法能够量化含有miR-21-5p的EV数量。研究人员发现来自卵巢癌细胞系的2%-10%的EV显示出miR-21-5p的阳性信号，明显高于良性细胞的EV计数（<0.65%），这与使用金标准方法的批量分析具有良好的相关性。研究人员还发现，该方法可以与靶特异性EV在金磁盘阵列（gold disk arrays）上的免疫捕获相结合，以测量EpCAM阳性的肿瘤来源EV的miR-21-5p，结果显示卵巢癌患者血浆中的miR-21-5p阳性EV数量明显高于健康对照组。这证明了在不提取RNA的情况下在完整EV中特异性检测miRNA，以及对蛋白质和miRNA标记进行多重EV分析的可能性。
参考文献：CRISPR/Cas13a-Based MicroRNA Detection in Tumor-Derived Extracellular Vesicles. Adv Sci (Weinh). 2023 Jun 20:e2301766.
