细胞外囊泡(EVs)作为下一代药物递送方式正在获得越来越多的关注。将感兴趣的蛋白质与具有高EV分选能力的支架蛋白基因融合，代表了一种强大的货物装载策略。为了解决这种支架蛋白质的匮乏，近日，Nature Communications杂志上发表一篇文章，鉴定了更好的支架蛋白以改善细胞外囊泡携带目标货物的能力。
细胞外囊泡（EV）是由大多数类型的细胞分泌的膜包裹颗粒。通过携带多种大分子，EV由于其内在的嗜性和保护其腔内内容物免受快速降解而成为细胞间通讯的重要介质。结合良好的安全性，EV已经引起了人们对作为广泛疾病潜在下一代治疗模式的极大关注。
外泌体（EVs）的治疗应用主要依赖于其内容物。在最简单的情况下，EVs从其来源细胞中固有地携带治疗分子。例如，间充质干细胞来源的EVs已经反复证明了其母细胞的再生和免疫调节特性。EVs还可以通过内源或外源手段有意识地装载感兴趣的分子。外源装载是在预先分离的EVs上使用物理方法（如超声波、电穿孔或化学共价结合）进行的。这种方法主要局限于小型载荷，包括miRNAs和低分子量化学物质，并且与RNA沉淀和EVs的物理损伤或聚集相关的技术挑战有关。较大的载荷，如蛋白质，通常在生产细胞中内源性地加载。通常，生产细胞被遗传学指示过表达与EV分选蛋白融合的感兴趣蛋白，从而增强了内源性载荷蛋白的排序。这种策略可以将分子定向到EVs的表面或腔内。与表面展示相比，腔内装载可以防止货物过早地解离/降解，并因此成为易于降解并在受体细胞的细胞质或核中起作用的分子的选择方法。研究已经证明了内源性装载的适用性，通过将蛋白质治疗剂（如超抑制IκB和受体蛋白诱饵）纳入或覆盖在EVs上。此外，这种方法允许通过将RNA结合蛋白与EV分选蛋白融合来间接装载RNA治疗剂。
虽然内源性负载是一种多功能的策略，但它本质上是由EV群体中的分选蛋白质丰度所决定的。这不仅涉及到它可以达到每个EV的水平，更重要的是涉及到它在不同的EV亚群中的存在。一般来说，EV群体是异质性池，迄今为止该领域难以将其表征并物理分离为不同的亚群，这使得内源性负载策略变得复杂。好在，从国家癌症研究所（NCI-60）的60种不同细胞类型的EV中发现有213种蛋白质是保守的，因此可以作为潜在的EV排序候选者。然而，到目前为止，只有少数蛋白质已经被很好地表征用于将蛋白质装载到EV中。其中大多数是属于四跨膜超家族的多通道跨膜蛋白质，例如CD9、CD63和CD81。考虑到EV的异质性，在CD63-GFP融合蛋白过表达时，在大多数情况下会导致51%的GFP阳性颗粒。已经做出了努力来确定替代EV分选候选者，这些替代品对PTGFRN和BASP1以及TSPAN14显示出了希望。这些研究集中在低通量、以GFP为中心的定量方法上，并包括最多14个候选蛋白质。
用于量化EV中管腔货物蛋白的生物发光筛选方案
该研究进行了一项大规模的比较研究，包括244个潜在的候选者，以获得更全面的画面，并希望找到其他EV分选蛋白质。在整个研究过程中，TSPAN2、TSPAN3和CD63始终表现为高效的EV分选蛋白质，具有不同生产细胞类型的强大的腔内装载能力。此外，TSPAN2和TSPAN3工程化的EV不仅在体外和体内表现出高效的摄取能力，而且由于有丰富的工程可能性（即表面展示和腔内货物装载），因此还具有潜在的递送模式。因此，作者认为这一发现为内源性工程方法提供了一个基础，以将货物装载到或进入EV中，从而实现潜在的治疗应用。
TSPAN2和TSPAN3工程EV的生物活性
该研究利用一种简单可靠的检测方法，可以区分囊泡内和表面货物蛋白以及非囊泡蛋白，并比较244个候选蛋白的EV分选潜力。研究确定了24种在五种生产细胞类型中具有保守EV分选能力的蛋白质。TSPAN2和TSPAN3成为领先候选者，并超越了CD63支架的研究。重要的是，这些工程EV在细胞培养和小鼠中显示出作为递送载体的潜力，如有效转移管腔货物蛋白以及不同功能实体的表面显示。这些支架的发现为基于EV的工程提供了平台。
参考文献：
Zheng W, Rädler J, Sork H, Niu Z, Roudi S, Bost JP, Görgens A, Zhao Y, Mamand DR, Liang X, Wiklander OPB, Lehto T, Gupta D, Nordin JZ, El Andaloussi S. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 2023 Aug 7;14(1):4734. doi: 10.1038/s41467-023-40453-0. PMID: 37550290; PMCID: PMC10406850.
