作为细胞外囊泡的亚型之一，外泌体通过多囊泡体（MVBs）与细胞膜（PM）融合被释放到细胞外，介导细胞间交流，广泛参与调控体内各项生理和病理过程。肿瘤细胞分泌的外泌体参与肿瘤发生和演变的多个过程如肿瘤生长、转移、耐药、免疫逃逸等，其对于肿瘤的发生发展具有重要促进作用。然而，目前肿瘤外泌体分泌的机制尚不清楚。
2023年9月13号，华中科技大学生命科学与技术学院马聪团队和杨祥良团队在Journal of Extracellular Vesicles上发表题为“Identification of the SNARE complex that mediates the fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane in exosome secretion”的研究论文（DOI：https://doi.org/10.1002/jev2.12356），发现了由Syntaxin-4，SNAP-23和VAMP-7组成的SNARE复合体在乳腺癌细胞内特异性驱动MVB与PM融合以完成外泌体分泌的最后步骤，并揭示了介导肿瘤外泌体分泌的SNARE蛋白对于肿瘤生长及转移的重要性，表明该SNARE蛋白作为肿瘤治疗干预靶点的巨大潜力。
该研究首先利用全内反射成像（TIRF）技术（图1）并结合竞争性抑制策略，发现在人乳腺癌MCF-7细胞内分别过表达Syntaxin-3, -4, -11以及-18的SNARE结构域截短体抑制外泌体释放，提示该4个Qa-SNARE可能参与外泌体释放过程。
图1 TIRF监测外泌体释放示意图
接下来，该研究在细胞内共表达Qa-和Qbc-SNARE，利用confocal成像分别分析不同Qbc-SNARE（SNAP-23, -25, -29, -47）与上述4个Qa-SNARE的共定位情况，发现除了SNAP-47以外，SNAP-23, -25和-29与Syntaxin-3, -4及-11均有较高的共定位水平，但在MCF-7细胞内并未检测到SNAP-25的表达，因此，SNAP-23和SNAP-29被认为是介导外泌体分泌的潜在Qbc-SNARE并进一步对其功能进行探究。
蛋白共定位并不代表蛋白间存在相互作用，基于蛋白共定位筛选，下一步，该研究利用荧光寿命成像（FLIM）（图2）在细胞内分别对Qa-和Qbc-SNARE间的互作进行探究，发现Qa-SNARE Syntaxin-4和-11与Qbc-SNARE SNAP-23和-29间存在较强的互作。
图2 FLIM监测Qa-/Qbc-互作示意图
负责MVB与PM融合的R-SNARE定位于MVB上，利用R-SNARE的亚细胞定位特点，该研究分析了R-SNARE（VAMP-2, −3, −4, −7, −8, and Ykt6）与MVB标志蛋白CD63的共定位，发现VAMP-7与CD63存在非常高的共定位；此外，VAMP-2及VAMP-8与CD63也存在一定的共定位。
经过上述筛选，该研究在MCF-7细胞内分别敲除Syntaxin-4和-11，SNAP-23和-29，VAMP-2, -7和-8，定量分析不同SNARE蛋白的缺失对外泌体分泌水平的影响，发现Syntaxin-4, SNAP-23和VAMP-7对于乳腺癌细胞外泌体的正常释放至关重要。接下来，该研究综合透射电镜、荧光成像、脂质体融合等多项技术手段，从细胞和分子水平确定Syntaxin-4, SNAP-23和VAMP-7均不参与MVB形成和转运等分泌前期步骤，其组成的SNARE复合体特异性驱动MVB与PM融合，完成外泌体分泌的最后步骤（图3）。同时，该研究在人宫颈癌和黑色素瘤细胞内验证了Syntaxin-4, SNAP-23和VAMP-7在外泌体分泌功能中的保守性。
图3 Syntaxin-4, SNAP-23和VAMP-7组成的SNARE复合体特异性驱动MVB与PM融合
最后，该研究通过建立小鼠乳腺癌原位模型和转移模型，发现通过敲除VAMP-7来阻断肿瘤外泌体分泌可显著抑制肿瘤生长和转移（图4），反之，通过静脉注射体外纯化的外泌体进入小鼠体内可促进VAMP-7缺失肿瘤的生长和转移，展示了介导肿瘤外泌体分泌的SNARE蛋白作为肿瘤治疗干预靶点的巨大潜力。
图4 VAMP-7敲除显著抑制肿瘤生长和转移
这项研究深化了对肿瘤外泌体分泌机制的了解，对于精确调控肿瘤细胞外泌体释放进而有效干预肿瘤病理过程具有重要意义。
参考文献：
Identification of the SNARE complex that mediates the fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane in exosome secretion, J Extracell Vesicles. 2023 Sep;12(9): e12356. doi: 10.1002/jev2.12356.
外泌体资讯网 JEV | 华中科技大学生命科学与技术学院马聪团队联合杨祥良团队鉴定了在外泌体分泌过程中介导多泡体与质膜融合的SNARE复合体
