外泌体作为细胞来源的纳米材料，被用于治疗骨相关疾病。骨骼一个动态的组织，通过成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收的平衡进行不断的重塑。外泌体是纳米直径范围内细胞分泌的膜囊泡，以旁分泌或内分泌方式输送核酸、蛋白质和脂质，从而调节受体细胞的生物学功能。同时外泌体的临床应用正得到广泛关注，作为一种“无细胞”治疗技术，将克服应用干细胞技术存在的一些问题，诸如细胞来源、治疗时间、免疫风险和医疗费用等。外泌体给药被认为是用于无细胞骨骼修复和病理疾病治疗的一种有吸引力的方法和具有目的疗效和更强治疗效果的临床新技术。
2023年8月20日，山东第一医科大学附属聊城医院/山东省聊城市人民医院刘凤珍团队联合刘琨团队在Regenerative Biomaterial发表题为“MicroRNA-21a-5p-modified macrophage exosomes as natural nanocarriers promote bone regeneration by targeting GATA2 ”的研究论文 (2023 Aug 31;10:rbad075)。第一作者为罗新，通讯作者为刘凤珍和刘琨。
众所周知，骨组织的再生修复是一种多细胞多因子多步骤时序性行为的结果。局部免疫微环境对骨形成有重要调控作用，免疫细胞尤其是巨噬细胞在成骨过程中发挥着关键作用。早期炎症阶段，巨噬细胞呈现M1促炎表型；中后期骨形成及重塑阶段，巨噬细胞从M1向M2表型转变，巨噬细胞呈现M2抑炎表型。该研究发现MiR-21a-5p是M1巨噬细胞中高表达的microRNA，并通过外泌体miR-21a-5p确定M1巨噬细胞对骨愈合的影响及其可能的机制。该研究将过表达miR-21a-5p的M1巨噬细胞外泌体注射到骨缺损部位可以增强体内骨再生。此外，通过直接靶向GATA2, miR-21a-5p加速了MC3T3-E1的成骨分化。结果表明，来自M1巨噬细胞的外泌体miR-21a-5p可能被转运到成骨细胞并靶向GATA2以促进骨缺损愈合。
图1 M1巨噬细胞来源的外泌体miR21a-5p靶向GATA2促进骨再生
作者探讨了M1巨噬细胞外泌体和M1巨噬细胞外泌体miR-21a-5p对MC3T3-E1成骨细胞分化的影响。研究结果显示，miR-21a-5p的下调抑制了成骨基因的表达，而miR-21a-5p的过表达促进了成骨基因的表达。
图2 M1巨噬细胞外泌体miR-21a-5p促进MC3T3-E1成骨分化
外泌体在体内的快速清除和缺乏组织靶向性限制了它们的治疗潜力。该研究使用水凝胶包封外泌体，改善其在体内的滞留，从而提高其治疗效果。结果表明，外泌体分布在水凝胶骨架上，在水凝胶中稳定缓慢释放约14天。
图3 Mir -21a-5p修饰的M1巨噬细胞外泌体与水凝胶复合物治疗大鼠颅骨缺损
该研究构建大鼠颅骨缺损模型，将水凝胶负载的M1巨噬细胞外泌体和过表达miR-21a-5p的M1巨噬细胞外泌体置于缺损中。结果表明，与水凝胶复合过表达miR-21a-5p的M1外泌体显示出良好的成骨潜能。
图4 M1巨噬细胞外泌体miR-21a-5p加速大鼠颅骨缺损愈合
接下来，该研究通过用过表达miR-21a-5p的慢病毒处理细胞，探索了miR-21a-5p直接影响MC3T3-E1的能力，结果表明，慢病毒感染显著增加了miR-21a-5p在MC3T3-E1中的表达。通过ALP染色、素红染色和测定成骨基因表达检测miR-21a-5p对MC3T3-E1成骨分化的影响。结果验证了miR21a-5p直接诱导MC3T3-E1骨化的能力。
图5 MiR-21a-5p体外诱导MC3T3-E1成骨细胞分化
根据数据库(http://www.targetscan.org)， miR21a-5p可以直接结合GATA2的3’UTR，而GATA2是ALP的转录因子。此外，GATA2负向调控成骨分化。在MC3T3-E1中过表达miR-21a-5p，并通过qRT-PCR和western blot检测GATA2的表达，发现miR-21a-5p降低了GATA2 mRNA和蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验结果表明，突变GATA2的3’UTR区，miR-21a-5p不再结合抑制荧光团酶活性。
图6 GATA2为miR-21a-5p靶基因
为了探究MC3T3-E1细胞成骨分化对GATA2的依赖性，该研究同时过表达miR-21a-5p和GATA2来检测MC3T3-E1的成骨分化。结果表明，miR-21a-5p过表达部分挽救了GATA2对MC3T3-E1成骨分化的负面影响。
图7 MiR-21a-5p在体外靶向GATA2诱导成骨细胞活性
总之，该研究为M1巨噬细胞外泌体miR-21a-5p通过抑制GATA2促进骨愈合提供了有力支持。因此，局部注射过表达miR-21a-5p的M1巨噬细胞分泌物可能是一种有希望的增强骨修复的治疗策略。该研究工作为利用外泌体促进骨再生的治疗提供了新的方法，同时也为通过基因工程改造外泌体治疗其他疾病提供了新的思路和策略。
参考文献：
MicroRNA-21a-5p-modified macrophage exosomes as natural nanocarriers promote bone regeneration by targeting GATA2. Regen Biomater. 2023;10:rbad075. doi: 10.1093/rb/rbad075.
