Clark等人使用串联质谱标记技术（tandem mass tagging ,TMT）联合支持向量机（support vector machine，SVM）多变量聚类分析来识别乳腺癌外泌体的蛋白质组。为了能够充分展示液体活检诊断潜力，该团队提出了一个工作流程，既可以完成蛋白质鉴定，并可以确保无杂蛋白污染物的干扰。
外泌体是由细胞释放的小泡。癌症外泌体里包含了mRNA、miRNA以及其它蛋白质，包括一些参与肿瘤发生发展的原癌基因和蛋白。外泌体的典型结构是尺寸40-130纳米的杯状形态，这些囊泡在血液中循环，并可能是液体活检诊断的循环癌标记物。临床医生可能会根据血检结果来诊断和鉴定癌症，监测对治疗的反应，以及提供预后建议。
然而，鉴别蛋白质组是很困难的，因为从细胞本身非外泌体来源的蛋白质或其他因素会干扰实验结果。出于这个原因，研究人员通常使用富集技术，诸如免疫、超离和电子显微镜（EM）来制备样品和验证结果。
Clark等人利用液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）的方法，将样品制备过程中产生的各种富集的蛋白质做了直接比较。研究人员推测，他们可以很容易地通过该比较确定外泌体的蛋白质，因为它们仅仅在富集的部分存在。研究材料是转移性乳腺癌细胞系SKBR3B的24小时培养基（conditioned medium，CM）。
首先，该团队根据以下离心和浓缩过程，收集了三个组分的无细胞上清液，每一部分都有相应的外泌体物质的积累：
10 K pellet：Centrifuge at 10,000 xg for 30 minutes
100 K pellet：Centrifuge at 100,000 xg for 70 minutes
Opti pellet：利用密度梯度法，通过外泌体特异的标志物筛选外泌体
每部分收集好之后，Clark等人按照标准胰酶消化的步骤进行。肽段样品制备好后，加入TMT标记试剂并利用Orbitrap XL质谱仪（Thermo Scientific）进行LC-MS/MS分析。
接下来研究人员获得了光谱数据，他们确定了三个实验组分的蛋白质和测量丰度。他们还比较了从传统的尺寸排阻色谱获取的外泌体富集的样品，并使用免疫印迹鉴定蛋白质。该团队还通过电子显微镜观察了典型的大小和形态的外泌体。
验证了这一方法学之后，Clark等人建立SVM聚类分析以确定外泌体的起源。他们分析了LC-MS/MS的2179蛋白质；通过SVM聚类分析得到了5个外泌体和8个非外泌体的蛋白标记，以及251蛋白质是外泌体蛋白质组来源的。
作为进一步的验证步骤，研究人员重新分析了数据，量化的12种质膜标记物，可能可以反映出在富集外泌体中的部分碎片和蛋白污染水平。他们发现，只有整合素α-V和CD151会在外泌体蛋白中聚集，但SVM分析里概率很低。
综上，Clark等人对该乳腺癌外泌体蛋白质组的识别方法很有信心，而且可以识别混合的杂蛋白。另外，他们认为对该方法进行修改，以便成为其他癌症外泌体的检测工具。
参考文献：Clark DJ, Fondrie WE, Liao Z, Hanson PI, Fulton A, Mao L, Yang AJ. (2015) Redefining the Breast Cancer Exosome Proteome by Tandem Mass Tag Quantitative Proteomics and Multivariate Cluster Analysis. Anal Chem 87(20):10462-9.
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外泌体资讯网 Anal Chem：乳腺癌外泌体蛋白质组的串联质谱分析
