近年来，信使RNA（mRNA）在各种临床应用中展示了巨大的治疗潜力。然而，如何实现组织和细胞的靶向递送仍然是当前mRNA基因治疗面临的主要挑战。细胞外囊泡（EVs）具有优异的稳定性、生物安全性和相容性，以及能够穿越血脑屏障等优点，逐渐成为mRNA基因治疗的递送载体。虽然小型EVs（sEVs）已成功用于递送全长序列的mRNA进行癌症治疗，但尚有报导来评估携带特异性mRNA的sEVs，用于恢复肿瘤免疫原性和提高肿瘤免疫治疗的效果。
近日，Nature Communications杂志发表一篇文章，介绍了一种微流控电穿孔系统，结合两步脉冲刺激方法，以产生大量过表达CD64的sEVs，并在其内部招募能够表达 IFN-γ 的mRNA。在这些治疗性sEVs中，CD64作为抗CD71和抗PD-L1抗体的对接位点，以促进sEV靶向到胶质母细胞瘤细胞（GBM）。该研究展示了这些免疫sEVs（imsEVs）可以成功靶向GBM并在体内诱导免疫疗效。此外，这种imsEV在到达肿瘤微环境后，可以引起主要组织相容性复合物I（MHC-I）的表达上调，避免可能由其下调触发的免疫逃逸，从而增强免疫疗法的抗肿瘤效果。这种imsEV是一种可以实现mRNA装载、肿瘤靶向和微环境调节，以提高癌症免疫疗法有效性的潜在方法。
大规模生产imsEV和其治疗机制示意图。作为mRNA的递送工具，使用纳秒电穿孔(nsEP)系统生成imsEV，并同时加载抗CD71、抗PD-L1和IFN-γ的 mRNA，用于GBM的治疗
通过纳秒脉冲电穿孔 (nsEP) 高通量生成sEV
通过nsEP系统大规模生成sEV。a.用于生成sEV的nsEP系统示意图.b. 小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 在未经处理的对照组、微秒电穿孔脉冲 （msEP）、nsEP 和 nsEP/PBS 治疗组中每个细胞产生的的 sEV 数。
为了设计一个能够产生高效mRNA负载sEVs的电穿孔系统，源细胞需要经历两步电穿孔过程。首先，使用纳秒电穿脉冲瞬时渗透源细胞内部的细胞器膜结构，然后将其暴露于透化细胞质膜的毫秒脉冲中。这种纳秒脉冲电穿孔（nsEP）方法可以提高细胞的转染性能，并大规模生成sEVs。nsEP 刺激的细胞分泌的 sEV 与天然分泌组（未处理的对照）分泌的 sEV 的大小分布相似，具有相同的形态特征，均约 120 nm 大小。调整nsEP的脉冲参数可以进一步优化sEV分泌量，最多可使小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的sEV产量相对于对照组增加了45倍。通过微流控设置和多个单元并行运行，可以实现 sEV 的大产能和高吞吐量生产 （5.0 × 107细胞在 5 分钟内），对于许多临床应用来说就足以处理所需要的时间以及递送所需要的sEV 的数量。
RT-qPCR检测IFN-γ mRNA表明，nsEP处理产生的sEVs含有比其他方法产生的sEVs含有更多的mRNA，比对照样品高了1000倍。
imsEVs的制备和表征
imsEVs制备原理示意图
为了制备imsEVs用于GBM的免疫治疗，首先构建了一个稳定表达CD64-DsRed（CD64-DsRed+）的MEF细胞系。使CD64表达于我们生产的sEVs的表面，并确认CD64的N-端定位于这些sEVs的外部表面。为了实现目标 mRNA 主动加载到 sEV 中，我们利用了 N 肽，它能特异性地结合 RNA 中的 box B 序列.我们将 N 肽克隆到 CD64 蛋白的 C 末端（最后位于 sEV 内部），同时通过工程化IFN-γ 质粒，将box B 序列整合到IFN-γ mRNA 的 3' 端。简而言之，融合到 CD64 C 末端的 N 肽能够特异性结合box B 序列，将 IFN-γ mRNA 募集到 sEV 中。然后，将box B-IFN-γ或对照IFN-γ转染到稳定表达CD64-N肽的MEF中，并通过RT-qPCR分析收集分泌的sEV中的mRNA。后续的实验结果也验证了该主动装载策略实现募集特定mRNA进入imsEV。利用CD64（Fcγ受体）可以结合IgG重链的恒定区。随后将抗CD71（GBM靶向）和抗PD-L1（免疫疗法）抗体与sEVs分别共孵育，达到将其附着到imsEVs的表面，以使其能够特异性地靶向GBM，产生免疫治疗效果。
sEVs和imsEVs的收集和纯化
sEVs的收集和纯化是通过超速离心法进行的。在细胞转染之前，去除含血清的细胞培养基。纳秒电穿孔(nsEP)后，细胞在不含外泌体的培养基中培养48小时。然后，将细胞培养上清液在2000×g下离心10分钟以去除碎片，大型囊泡和凋亡体在10000×g下离心30分钟以去除。最后，通过超速离心法在100,000×g下纯化sEV。为了制备imsEVs，CD64-sEVs与抗CD71 mAb和抗PD-L1 mAb（1：1：3，w/w/w，CD64-sEV按蛋白质质量计）在37℃下孵育2小时。随后，通过超速离心法在100,000×g下离心2小时去除游离抗体。
sEV、CD64-sEV、imsEV的Cryo-EM照片
imsEV在临床前模型中的治疗效果
通过溶血毒性实验以及小鼠生物安全性和生物相容性实验，验证了这些imsEV在体内给药的安全性问题之后。作者选择GBM作为临床前模型系统，用于研究imsEV在体内的免疫治疗潜力。 GBM是一种侵袭性肿瘤，目前没有有效的治疗方法，并且对免疫治疗没有反应。另一个主要障碍是肿瘤表面的MHC-I蛋白下调所导致的抗原呈递不良。低突变载量，相应的浸润性T细胞和M1巨噬细胞很少，加剧了MHC-I的下调，形成了高度免疫抑制的肿瘤微环境。
组织分布分析表明，imsEV在肝脏蓄积低的情况下显示出更高的脑靶向性
将5×1011的imsEV剂量静脉注射到植入GL261肿瘤的具有免疫能力小鼠中，这些肿瘤具有适当的免疫原性。体内成像系统（IVIS）的结果显示，与非靶向sEV相比，注射后2和4小时肿瘤内 imsEV 的积累显着增加，肝脏积累相应减少，结果表明imsEV具有显著的肿瘤靶向能力。
imsEV治疗延长了GL261胶质瘤小鼠的生存期。
将imsEV每3天给予GL261肿瘤携带的小鼠，可显著抑制肿瘤生长，并延长存活时间，imsEV处理小鼠的中位存活时间为53天，而抗体组合处理小鼠的中位存活时间为35天，对照组为29天。
imsEV 在原位 SB28 神经胶质瘤模型中的体内治疗效果。g通过磁共振成像评估的治疗后肿瘤大小。H&E染色显示imsEV抑制肿瘤组织中的细胞增殖。
作者继续研究了其在原位SB28小鼠GBM模型中的抗肿瘤作用，该模型由于其固有MHC-I低表达，并且表型与人GBM相似。与在GL261模型中的观察的结果类似，imsEV在SB28肿瘤中的积累程度比非靶向sEVs更高，在imsEV治疗后肿瘤生长也大大减少了，生存时间得到了延长（imsEV治疗组的中位生存时间为50天，而PBS治疗组的中位生存时间为27天）。
总之，该研究发明了一种高效生产具有靶向功能的sEVs载体，并将其用于递送目的mRNA的方案。该方法为癌症免疫治疗开辟了新的道路，为提高免疫耐药肿瘤的响应性开辟新途径。当然，在人类临床环境中应用改良的 sEV 之前，需要进一步的完善其生产、稳定性、质量控制和安全性评估等方面信息，同时必须进行临床前研究并严格遵守相应的监管指南。
参考文献：
Dong, S., Liu, X., Bi, Y. et al. Adaptive design of mRNA-loaded extracellular vesicles for targeted immunotherapy of cancer. Nat Commun 14, 6610 (2023).
外泌体资讯网 工程化细胞外囊泡递送mRNA用于癌症靶向免疫治疗
