血液是获取和研究细胞外囊泡（EVs）最常用的体液。虽然血液是临床分析的标准选择，但将血液作为EVs的来源引入了多层次的复杂性。在2022年的血液细胞外囊泡研讨会上，明显地看到初学者研究人员缺乏关于如何开始血液EV研究的经验。来自荷兰阿姆斯特丹大学的研究人员发布了一份指南，解释了血液的组成和常用术语，提供了血液采集和血浆、血清制备的指南，介绍了在考虑与血液相关的因素的同时，分离和检测血液EVs的基本原理。本指南的目标是通过提供目前血液EVs研究进展介绍，从而帮助初学者快速入门。相关综述内容以“A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum”为题在线发表于1月9日的国际细胞外囊泡学术期刊Journal of Extracellular Vesicles上。
血液及其衍生物血浆和血清是细胞外囊泡（EV）研究中最常研究的体液。血液是一种复杂的体液，更确切地说是液体形式中的组织基质，其中包含存在于血浆中的各类细胞。血液中存在的细胞类型包括白细胞（或白血球）、红细胞（或红血球）和血小板。血浆主要由水和高浓度的可溶性蛋白质、脂蛋白组成，而且相对较少的是细胞外囊泡。
尽管非血液细胞衍生的EV的浓度和细胞来源尚不清楚，但通常认为在病理状态下发生变化。由于全血中存在大量细胞（约占血容积的50%），几乎不可能直接在整个血液中研究EVs，因此第一步通过离心分离细胞，再从血液中分离出EVs。通过这种方式，得到了含有EVs的血浆，这是研究血液EVs最常用的起始材料。
血液的组成是与供体有关的，被称为个体间或生物标本变异。例如，健康的男性供体平均而言比女性具有更高浓度的红细胞。影响血液组成的其他因素包括年龄、昼夜节律、生活方式和药物。生活方式如何直接影响血液组成的一个众所周知的例子是饮食。在进食后的餐后状态，血液（包括血浆和血清）中的脂蛋白浓度相较于供体禁食时增加。由于脂蛋白在大小和/或密度上与EVs重叠，它们妨碍了EVs的分离和检测。在这项指南中，研究人员主要关注点在健康人体的血液上。
这篇文章提供的指南为获得人类血浆和血清原始材料用于EV制备提供了全面的说明，关键要点如下：
1 献血者
1.1 匹配对照组： 使用在年龄、性别、药物等方面匹配的对照组进行准确的比较。
1.2 采集时间： 如果可能的话，尽量在同一天的同一时间采集血液，以减小变异。
1.3 排除初始血液： 排除从EV研究中收集的头2-3毫升血液，使用像EDTA管这样用于血液学分析的试管，以避免干扰。
1.4 静脉穿刺指南： 遵循临床静脉穿刺指南，包括针尺寸、使用停滞法以及监测血流直到最后一个试管，因为在收集多个试管时血液可能会激活甚至开始凝结。
1.5 禁食的影响： 过夜禁食有助于降低脂蛋白的浓度。
1.6 标准化： 标准化血样收集和处理的所有步骤，以减小患者和健康对照之间可能影响血液EV和样本质量的系统差异。
2 抗凝
2.1 抗凝剂的选择： 不同的抗凝剂对凝血和血小板激活有不同的影响。考虑与下游分析的兼容性，例如肝素由于结合DNA而抑制PCR反应。
2.2 血小板抑制： 一些抗凝剂（ACD、EDTA）有效地抑制血小板激活，从而减少在血液收集和处理过程中释放的血小板源性EV。
2.3 血清与血浆的区别： 认识到血清样本与血浆样本之间存在差异，尤其是在血小板源性EV方面的影响。
2.4 避免混合样本： 不要混合不同抗凝的样本或血浆和血清样本。
3 血浆和血清的制备
3.1 离心步骤： 目前，制备血浆的常见程序包括两个离心步骤。我们建议使用相同的程序制备血清。
3.2 使用已建立的程序： 为确保一致性和有效性，使用已建立且常用的血浆制备程序，或提供去除血小板等方面的有效性证据。
3.3 标准化处理时间： 标准化所有献血者的处理时间和抗凝剂，因为变异可能影响血浆EV的浓度。同样，标准化血清制备程序，因为血液允许凝结的时间会影响血清EV的浓度。
3.4 丢弃或报告异常样本： 丢弃或报告呈混浊（脂肪）、橙色或红色（溶血）、包含可见块状物或不溶解的细丝（抗凝不足）的血浆或血清样本。
3.5 避免冷激活： 血小板对冷激活敏感，所以不要将含有血液的试管放在冰箱或冰上，并在室温下执行所有程序。
3.6 离心考虑事项： 在离心过程中不要使用刹车，因为血小板（存在于白细胞层）可能会重新进入血浆。使用相同的离心机或在不同的样本收集站点使用每台仪器的相同协议。另外，通过测量残留血小板浓度等方式监测制备的血浆或血清样本的质量。
3.7 材料的选择： 用于血浆处理的材料使用聚丙烯塑料。对于血清制备，可以使用玻璃试管或商业血清试管。虽然有不同类型的血清试管，但它们对EV的存在、组成和功能的影响仍然大部分未被探索，需要进一步研究。
3.8 降低血小板浓度： 在采集血浆时，采集距离细胞（白细胞层或凝块）远一些的位置，可以降低残留血小板的浓度。这一步骤的标准化可以提高血浆样本的质量，并减少操作者之间的个体差异。
3.9 血小板浓度测定： 在离心后，可以使用临床血液学分析仪或流式细胞术确定血浆和血清样本中残留血小板的浓度。即使采用双重离心程序（例如，2 × 2500 g，不使用刹车，在移液过程中保持一厘米安全距离），制备的血浆仍可能含有大约0.5%–1.0%的原始血小板浓度。
3.10 血小板去除： 如果需要进行生物标志物研究，残留的血小板可以通过过滤来去除。但需要注意的是，过滤也可能会去除大型外泌体。
3.11 测量和报告血小板残留浓度： 当建立了程序后，应测量和报告血浆和血清样本中的残留血小板浓度。
3.12 血小板和其他残留细胞的影响： 存在于血浆和血清中的血小板以及其他残留细胞或残留物，可能会在冻融循环过程中发生碎裂。
3.13 存储对血浆和血清EV存在、组成和功能活性的影响： 目前存储对血浆和血清EV存在、组成和功能活性的影响了解不足。
4 报告
避免使用常见术语，如无血小板血浆、去除血小板血浆或贫血小板血浆，因为这些术语不明确且在科学上没有定义。相反，通过报告残留血小板的浓度，定义如何使用分离程序从而获得提取EV的起始材料。还建议在实验室建立方法后评估残留脂蛋白的数量。
在您的手稿中提供有关样本性质、实验前处理和所用仪器检测水平的详细信息。若需要报告内容的指导，请使用最新的检查表，比如流式细胞术或生物库样本的检查表。
随时关注ISEV提供的最新教育资料，以提高您对当前指南和最佳实践的理解和遵循。
因此，这篇文章提出的指南强调标准化、对献血者变量的谨慎考虑以及适当的处理程序，以确保从人类血浆和血清中获得可靠和可重复的EV研究结果。
参考文献：A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 2024;13(1):e12400.
外泌体资讯网 JEV丨一份研究血浆/血清细胞外囊泡的初学者指南
