外泌体是一类内吞起源的细胞外囊泡，在体内的细胞间相互通信的旁分泌信号中发挥着至关重要的作用。然而目前对这些循环纳米颗粒的了解存在局限，这妨碍了细胞特异性外泌体的高效分离、表征和下游功能分析。来自美国印第安纳大学医学院的研究人员开发了一种方法，从人类慢性伤口液中分离和表征角质细胞源外泌体（hExoκ）并进行了特征表征，并且基于脂质指纹识别了源自糖尿病和非糖尿病慢性伤口患者的外泌体之间的明显差异。本研究中对临床样本中特定细胞单个外泌体进行的严格纳米级别的表征为理解主要的糖尿病并发症提供了关键见解，这在临床上得到了呈现，并为处理其他疾病过程的类似临床研究铺平了道路。相关内容以“Nanoscopic and Functional Characterization of Keratinocyte-Originating Exosomes in the Wound Fluid of Non-Diabetic and Diabetic Chronic Wound Patient”为题发表于2023年10月的国际材料化学领域顶级学术期刊Nano Today上。
生物体液体中富含纳米尺寸的膜结合细胞外囊泡（EVs；Ø 50–1000 nm），通过旁分泌机制在细胞间通信中发挥着至关重要的作用。EVs在大多数体液中丰富存在，如血液、尿液、唾液和乳汁。EVs被认为是异质的，其物理特性（大小、密度、组成）、细胞起源、分子组成和/或功能存在差异。传统上，通常将EVs分类为外泌体（exosomes）和膜起源颗粒，如胞外体（ectosomes）、微粒（microparticles）和凋亡体（apoptotic bodies）。与其他膜起源的EVs不同，外泌体（Ø 50–150 nm）是内吞来源的，有选择地包装了独特的基因组，如mRNA/miRNAs、蛋白质和抗微生物肽（AMPs）。这种协调有序的分选机制的存在导致外泌体的旁分泌效应是一种主动的过程，并且与其他被动的脱落膜囊泡不同。外泌体作为组织微环境内细胞间通信的中介物的角色具有杰出的作用。
外泌体的分子组成反映了细胞起源的病理生理状态。因此，外泌体被认为是提供诊断和预后线索的强大标志物。随着对精细化工作的充分表征的外泌体的出现，值得注意的是，早期有关外泌体的文献和数据解释往往混淆并且有时具有误导性。具体而言，对特定细胞外泌体的研究相对较少，这使得解释从异质性EV池中得出的数据具有挑战性。其他因素，如不完整的标准和方法细节的报道，进一步增加了实验重复性挑战。人体伤口液体是EV的卓越储存库，与愈合结果有因果关系。研究团队之前的工作表明，从愈合慢性伤口患者的伤口液中分离出的EV在转分化巨噬细胞（mϕ）成为愈合表型方面比非愈合糖尿病患者更有效。普遍认为，角质细胞在皮肤创伤愈合和炎症中起着重要作用。新兴的证据将外泌体定位为伤口微环境的主要功能组成部分。伤口炎症的解决依赖于伤口部位角质细胞与mϕ之间通过外泌体基因转移的成功相互作用。基于先前的研究，研究团队在这里测试了这样一个假设，即在糖尿病条件下，驻留的角质细胞与血液源性伤口mϕ之间的交流受到损害，导致伤口部位持续炎症。然而，与小鼠研究不同，小鼠研究中可以使用遗传方法分离特定细胞外泌体，而从人类伤口中分离高纯度的角质细胞来源的外泌体更具挑战性。此外，对不同大小的不同纳米囊泡进行不适当分离技术的担忧限制了在人类受试者中揭示特定机制的能力。
在这项工作中，研究人员报告了一种从人类慢性伤口液中分离角质细胞来源的外泌体（hExoκ）的技术，这可能为糖尿病性伤口慢性化提供关键见解。研究人员发现了hExoκ在糖尿病患者伤口中的重要性。通过LC-MS-MS检测hExoκ中的KRT14，并通过Vesiclepedia和Exocarta数据库进行验证，确定表面KRT14作为hExoκ的可靠标记物。dSTORM纳米成像在人类慢性伤口液中确定了KRT14阳性细胞外囊泡（EV+κ），其中23%源自外泌体。使用KRT14和tetraspanin抗体的免疫磁两步分离法成功地从15名非糖尿病和22名糖尿病患者的慢性伤口液中异质性的EV池中分离出hExoκ。分离的hExoκ（Ø 75–150 nm）按照EV-track指南进行了表征。使用在线CODI平台分析的dSTORM图像，并通过Nanometrix进行独立验证，显示hExoκ的Ø为80–145 nm。
在糖尿病伤口液中，hExoκ的丰度较低，与患者的HbA1c水平呈负相关。从糖尿病伤口液中分离的hExoκ显示，小于200 bp的小RNA的丰度较低。拉曼光谱强调了非糖尿病和糖尿病hExoκ表面脂质的差异。对单核细胞来源的巨噬细胞（MDM）对hExoκ的摄取在糖尿病患者中较非糖尿病患者低。与来自非糖尿病患者的hExoκ不同，将糖尿病患者的hExoκ添加到LPS和INFγ极化的MDM中导致iNOS和促炎趋化因子的持续表达，这些趋化因子已知能招募巨噬细胞。这项工作首次深入探讨了来自慢性伤口液的hExoκ的结构、组成和功能，为在糖尿病并发症条件下，如慢性伤口愈合不良，研究外泌体功能障碍奠定了基础。
参考文献：Nanoscopic and Functional Characterization of Keratinocyte-Originating Exosomes in the Wound Fluid of Non-Diabetic and Diabetic Chronic Wound Patients. Nano Today. 2023;52:101954.
