血脑屏障（BBB）限制了系统性传递送mRNA到患病神经元中。尽管白细胞来源的细胞外囊泡（EVs）可以穿越BBB，但有效地将长mRNA装载到EVs中并增强其神经元摄取仍然具有挑战性。近日，康奈尔大学江绍毅团队与麻省理工学院（MIT）的Robert Langer教授合作在Nature Biomedical Engineering杂志上发表文章，报道了一种通过工程化白细胞产生包含类似逆转录病毒的mRNA包装外壳的EVs来增强mRNA装载和神经元摄取的方法。
系统性药物传递到神经元受到血脑屏障（BBB）的限制，以及载体的神经元摄取率低和对神经元的低载荷释放。大多数生物制品，如重组蛋白、治疗性抗体和核酸，都不能穿越BBB。腺相关病毒（AAVs）可以将DNA传递到神经元，而重组蛋白和治疗性抗体可以与某些肽的受体介导的转运体结合时穿越BBB，例如胰岛素或转铁蛋白。信使（m）RNA已经成为预防和治疗疾病的新型治疗药物。然而，为了在体内发挥作用，mRNA需要安全、有效且稳定的传递系统，以保护mRNA免受降解，并允许载体的细胞摄取和内部释放荷。已经开发了各种病毒和非病毒载体，包括逆转录病毒载体、脂质纳米粒、聚合物、蛋白衍生物和细胞膜封闭的囊泡。然而，在体内RNA治疗的有效和靶向的递送仍然具有挑战性。
脑部炎症刺激导致血脑屏障（BBB）受到破坏；脑微血管内皮细胞（BMECs）表现出增加的渗透性，伴有白细胞粘附分子的升高。这使得循环中的白细胞来源的细胞外囊泡（EVs）能够进入大脑，成为靶向神经元的药物载体的理想候选。在各种神经系统疾病中，BBB对白细胞EVs的渗透性增加，包括与年龄相关的慢性炎症、神经退行性疾病，以及更严重的病理变化，如全身性炎症和继发性损伤（例如中风）。然而，基于EV的治疗方法在这些疾病的临床转化受到低载荷封装效率和无法控制从供体细胞中装载到EVs的分子的限制。EVs的载荷可能包括蛋白质、DNA、RNA、脂质、营养物质和代谢废物。不需要的细胞成分无法从EVs中排除，不仅影响了装载能力，还可能将潜在有害成分传递给靶标。
许多系统已经开发出用于将小RNA（如siRNA和miRNA）装载到细胞外囊泡（EVs）中，但是将长mRNA有效富集到EVs中仍然是一个挑战。已经报道了内源性EV相关RNA的极低拷贝数，范围从每个EV的0.02到1个RNA。与长mRNA相比，小RNA更有效地包装到EVs中（每个EV的0.01到1个miRNA vs 0.001个长完整RNA）。只有8%的供体细胞中的mRNA可以在其EVs中检测到。以前将mRNA装载到EVs的方法包括被动和主动封装。例如，通过超声和挤压后，通过与巨噬细胞来源的EVs孵育，或通过用皂苷渗透来治疗帕金森病。这种EV分离后装载的方法的载荷能力有限，因为已经装满供体细胞成分的EVs无法卸载以为药物腾出空间。EVs还可以在母细胞水平上进行工程改造。在自然条件下高效且有选择地将mRNA纳入EVs的能力对于将EVs设计为治疗药物载体至关重要。
为了提高RNA载荷装载到细胞外囊泡（EVs）中，作者在EVs的腔内加入了在人类大脑中自然存在的类似逆转录病毒的蛋白质外壳，这些外壳在促进中枢神经系统（CNS）内细胞间通信方面起着作用。横跨真核域，长端重复（LTR）逆转座子的可转座基因组元素，逆转录病毒从相同起源进化而来。LTR逆转录病毒和逆转座子的外壳蛋白（Gag）的同源物Arc（活性调节的细胞骨架相关蛋白）可能是并行进化的，并且与感染性RNA逆转录病毒的作用类似。另一个Gag同源物PEG10最近被伪装成形成体外mRNA传递的类病毒颗粒。Arc蛋白自组装成类似病毒的外壳，以封装mRNA。Arc外壳从神经元中释放出来，通过受体介导的内吞作用将mRNA传递到接收神经元中。尽管作为载体，Arc EVs在药物传递中具有巨大潜力，但其在药物传递中的研究尚未充分。在未添加其未翻译区域（UTRs）的情况下，Arc和Gag据报道在mRNA转导方面效率低，并且对特定载荷的特异性较小。在该研究中，将Arc 5’ UTR（A5U）添加到载荷构建中，稳定了外壳，增加了载荷装载能力。因此，作者将Arc蛋白外壳引入EVs的腔内，同时加入A5U RNA基序稳定剂，以实现mRNA的有效封装和传递。
除了增强了载荷装载能力外，该系统还具有其他几个优点。首先，由自身来源的白细胞产生的工程逆转座子Arc细胞外囊泡（eraEVS）在免疫学上是惰性的，并且在炎症微环境中积聚，通过供体白细胞的膜分子的帮助跨越血脑屏障。此外，Arc组分在自组装过程中招募包裹蛋白，并随后通过其在介导神经元之间分子交换方面的天然功能促进EVs的细胞摄取。此外，病毒样外壳使eraEVs比其他工程RNA装载的EVs更加稳定，保护载荷免受核酸酶降解，直到其释放被触发。除了利用这些独特的病毒样特性外，eraEVs是安全的。它们作为短暂的药物载体，无法复制、感染或将遗传信息插入接收者基因组。重要的是，基于不同细胞类型的EVs的天然靶向能力，eraEVs可以从大多数供体细胞中产生，并用于广泛的生物医学应用。该研究展示了一种内源性病毒样系统，能够在体内装载和传递mRNA，特别是通过全身给药将其传递到疾病神经元中。
通过A5U motif增强了Arc EV的稳定性
该研究转染了永生和原代骨髓来源的白细胞，使其携带编码外壳形成的活性调节的细胞骨架相关蛋白（Arc）以及稳定外壳的Arc 5’未翻译区域RNA元素的DNA或RNA。这些工程化的EVs继承了供体白细胞的内皮粘附分子，招募内源性包裹蛋白到其表面，穿越BBB，并进入神经元中的神经炎症部位。这些由自身来源的供体白细胞产生的EVs在免疫学上是惰性的，并且增强了低级慢性神经炎症小鼠模型中包装的mRNA的神经元摄取。
参考文献：
Gu W, Luozhong S, Cai S, Londhe K, Elkasri N, Hawkins R, Yuan Z, Su-Greene K, Yin Y, Cruz M, Chang YW, McMullen P, Wu C, Seo C, Guru A, Gao W, Sarmiento T, Schaffer C, Nishimura N, Cerione R, Yu Q, Warden M, Langer R, Jiang S. Extracellular vesicles incorporating retrovirus-like capsids for the enhanced packaging and systemic delivery of mRNA into neurons. Nat Biomed Eng. 2024 Feb 19. doi: 10.1038/s41551-023-01150-x. PMID: 38374224.
外泌体资讯网 【Nat Biomed Eng】细胞外囊泡整合逆转录病毒样衣壳，用于增强mRNA的包装并系统性递送至神经元中
