由所有细胞类型分泌的细胞外囊泡（EVs）参与了正常和疾病组织中影响细胞和组织表型的调节因子的细胞间传递。因此，EVs是血液和尿液中进行疾病诊断的分析的生物标记物靶点的丰富来源。然而，在分析复杂生物样品时，从特定细胞群体衍生的EVs中进行敏感的生物标记物检测是一个重要的难题。来自美国杜兰大学医学院的研究人员总结了目前简化EV的分离的创新方法，并讨论如何提高用于临床EV基因诊断和治疗所需的EV检测程序的灵敏度，包括纳米技术和微流控技术，实现对EV的表征，同时概述了EV基因检测的临床转化所面临的机会和挑战。相关内容以“A Panorama of Extracellular Vesicle Applications: From Biomarker Detection to Therapeutics”为题在线发表于3月12日的国际知名纳米材料学领域学术期刊ACS Nano上。
细胞外囊泡（EVs）在细胞间的通信与调节中发挥着重要作用，与疾病病理过程有关的过程也参与其中。由于这些纳米级颗粒被所有细胞类型大量分泌，可在细胞病理反应中特别发挥局部和系统作用。人们通过针对EV特异性生物标志物，开发快速、准确、敏感的检测方法，以检测与疾病过程相关的特定EV群体。EVs携带丰富的信息，在人体大多数体液中丰度较高，有助于简化诊断样本的收集。这些方法以EV分泌的生物分子（蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、DNA、脂质和代谢物）为靶标，作为疾病生物标志物来分析受损或患病细胞所分泌的EVs。这些源自EVs的生物标志物包含了丰富的诊断和预后信息，因为它们可以调节细胞间的通信、细胞维持、细胞成熟以及与疾病发展和病理相关的先天性和适应性免疫应答。因此，EVs源生物标志物已被提出作为多种传染性、慢性和恶性疾病的候选生物标志物。
然而，由于生物样本中存在多样的EV群体和各种纳米颗粒的污染物（蛋白聚集物、脂蛋白、细胞碎片等），特定EV生物标志物的敏感和准确检测变得复杂。单个EV分析方法的提出，可以避免这一问题，并评估EVs的完整谱系及其在疾病发展和病理中的潜在作用。然而，这种单个EV分析方法仍处于初级阶段，因为人们对EV生物发生的理解不完整，技术限制较多，目前也缺乏这些分析的标准化和验证方法。大量研究还致力于开发基于EV的治疗手段，利用其具有的理想性质（在体内具有稳定性、可渗透组织、对特定细胞/组织具有选择性并具备药物负荷能力）来调控与特定细胞类型相关的疾病发展和进展过程。这包括使用各种方法（基因工程、转染/融合、化学修饰等）来修改特定EV群体的内容或表面分子，从而改变它们的调控功能或细胞靶向特异性。然而，临床EV诊断应用面临的挑战包括难以收集、纯化、定量和处理EV样本，针对特定细胞类型分离EVs，以及对其病理效应的理解不足。"细胞外囊泡研究的最小信息"（MISEV）指南对于EV特性、处理和分析提供了推荐的流程，使得开发面向临床的EV治疗方法的过程更加简单。类似的特定方法指南已被证明对于推动使用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）、流式细胞仪和其他需要标准化指南来产生可靠数据的专业方法的诊断工具的发展是有用的。使用自动化系统进行EV分离和表征也加速了临床可行的基于EV的诊断应用的发展。
目前仍需要进一步发展标准化的EV处理程序，以确保在分析之前保持生物标志物的完整性，特别是针对早期诊断样本，其中信号强度可能非常低，在评估与疾病发展或进展相关的低浓度EV生物标志物的纵向样本中更是如此。标准化的EV制备和表征方法也是必要的，以确保EV治疗具有一致的安全性和疗效。此外，需要进一步的研究来确定与有效治疗反应相关的EV生物标志物，尽管“组学”研究可以在这个问题上提供重要的见解。使用EV诊断或治疗的临床应用将需要合理的方法，以简化工作流程并改进当前方法的性能。因此，研究人员对这个领域进行了综述，描述了基于EV的诊断和治疗进展和正在面临的挑战。在综述中，研究人员主要就以下几个方面进行了详细论述：
一、EV检测技术的进展
传统的EV分析方法，包括聚合酶链式反应（PCR）、免疫印迹（Western blotting，WB）和酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），费时费力，灵敏度中等，并且通常需要单独的EV纯化步骤，这些都会降低其用于临床应用的能力。然而，近年来在改进EV分析方法方面取得了巨大进展，以增强其灵敏度、特异性和在临床设置中的实用性，同时正在研究定制的纳米材料和微流控平台，以进一步提高其性能特征。荧光、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）、电化学和适配体等EV检测方法都可以组合使用，以在EV检测平台上实现敏感信号识别。
二、单个EV分析技术及其诊断潜力
近年来，发展能够以单个EV分辨率进行生物物理表征的先进方法已成为转化性EV研究的重点。生物样本中的EV非常异质，因为它们可能包含反映不同组织中各种细胞类型表型，例如，血浆EVs来源于组织内不同谱系或命运状态的细胞，或者肿瘤内具有不同遗传背景的细胞。单个EV分析技术可以评估EV亚群的异质性方面（例如大小和组成），检测复杂样本中低浓度的EV生物标志物，并检测单个EV或EV亚群上特定EV生物标志物的关联。所有这些可以提供有关疾病的发展和进展或治疗反应的信息，这些信息现在可以通过对复杂样本进行EV分析来检测到。单个EV分析方法采用了多种技术，其中几种不需要使用外源性标记，包括纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）、冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）、原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）和激光镊子拉曼光谱法。然而，许多这些方法在无标记方式下提供的信息有限，或者在没有独立EV分离程序的情况下就无法检测。采用NTA的无标记方法只能提供EV直径在群体中的分布估计，而冷冻电子显微镜和原子力显微镜方法还可以提供一些关于其构象表型分布的信息，而这三种方法都可能难以区分EV与可能污染EV分离物的蛋白聚集体和病毒。因此，单个EV分析方法越来越多地采用荧光亲和标记来检测特定的EV亚群进行分析。
三、EV的诊断、预后和治疗应用
由于EV具有识别和区分特定疾病以及离散疾病阶段的潜力，以及通过疾病相关EV生物标志物的变化来反映疾病细胞对治疗干预的反应，因此EV在感染性、慢性和恶性疾病的诊断应用中具有重要的前景。EV分离和表征预计将改善正在开发中的EV诊断和治疗方法，并提高它们在临床转化中的机会。值得注意的是，机器学习方法在区分和表征特定EV群体方面可能具有价值。
参考文献：A Panorama of Extracellular Vesicle Applications: From Biomarker Detection to Therapeutics. ACS Nano. 2024 Mar 12. Epub ahead of print.
