尽管有证据表明脑卒中患者在脑卒中前经常运动比不运动的预后更好，但具体的机制尚不清楚。此外，神经元死亡在脑缺血再灌注损伤导致的神经功能障碍中发挥了核心的作用。近日，来自中山大学附属第三医院的研究人员报道了预运动训练促进骨骼肌分泌外泌体miR-484通过抑制ACSL4进而减轻脑缺血再灌注损伤（tMCAO）缺血半暗带区神经细胞的铁死亡（机制图见图1）的研究成果。并以“Preconditioning Exercise Inhibits Neuron Ferroptosis and Ameliorates Brain Ischemia Damage by Skeletal Muscle-derived Exosomes via Regulating miR-484/ACSL4 Axis”为题发表在Antioxidants & redox signaling (2024 Mar 28. doi: 10.1089/ars.2023.0492. PMID: 38545792 ).中山大学附属第三医院康复医学科的黄牡丹、成世梅和李梓文博士为该文章的共同第一作者，中山大学附属第三医院康复医学科郑海清教授和中山医学院生物化学系李隽教授为该文的通讯作者。
为探究神经细胞在糖氧剥夺（OGD）环境下发生何种程序性细胞死亡（调节性坏死、凋亡、自噬和铁死亡）为主，研究团队使用各种细胞死亡的抑制剂分别处理神经细胞（调节性坏死、凋亡、自噬和铁死亡的抑制剂分别为Nec-1，ZVAD，3MA和Fer-1），使用相关试剂盒检测细胞活力和LDH释放，发现铁死亡抑制剂Fer-1最明显地减轻神经细胞在OGD环境下损伤程度。这提示神经细胞在OGD环境主要发生铁死亡。此外，Fer-1明显减轻神经细胞OGD环境下氧化损伤，并促进GPX4表达和抑制ACSL4表达（图2）。
为验证大鼠tMCAO后是否发生铁死亡及其在不同时间点的状态，研究团队分别建立Sham组和tMCAO后0.5h、1h、3h、6h、12h、24h、72h组。使用相关试剂盒检测缺血半暗带LPO和GSH水平、透射电镜观察铁死亡形态线粒体、免疫组化和Western blots检测GPX4和ACSL4，研究表明24h组铁死亡特征最明显(图3)，提示脑缺血再灌注损伤早期神经细胞发生铁死亡。为了评估预运动训练对脑缺血再灌注损伤后神经细胞铁死亡的影响，研究团队训练大鼠28天，然后进行tMCAO造模。研究结果表明预运动训练明显促进神经功能恢复及减轻脑梗死体积。透射电镜和LPO检测发现预运动训练明显减轻半暗带区神经细胞铁死亡的程度。此外， Western blots、免疫组化和免疫荧光检测发现预运动训练可明显上调GPX4和下调ACSL4的表达（图4）。有广泛研究证实外泌体参与了运动训练改善脑梗死后神经功能恢复的过程。该研究团队为了验证预运动训练是否通过脑脊液的外泌体减轻神经功能障碍，提取了不运动训练和运动训练大鼠的脑脊液外泌体。研究结果发现预运动训练大鼠来源的脑脊液外泌体可明显促进脑梗死大鼠神经功能恢复和减轻脑梗死体积，并促进梗死边缘区神经细胞尼氏小体存活（图5）。这提示预运动训练通过脑脊液外泌体发挥治疗作用。
为了探究预运动训练改善脑梗死神经功能恢复的具体分子机制，研究团队提取预运动训练来源的脑脊液外泌体进行高通量测序分析。鉴定出601个差异表达的miRNA。在这些差异表达的miRNA中，与未进行预运动训练组相比，预运动训练组有183个miRNA下调，418个miRNA上调。上调最明显的是miR-484, miR-152-3p 和miR-206-5p。进一步研究发现miR-484可明显调控铁死亡基因Acsl4（图6）。
图6 预运动训练脑脊液外泌体miR-484调控铁死亡基因Acsl4为了进一步探究预运动训练干预后，脑脊液外泌体miR-484的主要来源，研究团队提取了心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌和血液组织，采用qRT-PCR技术检测各组织miR-484前体和miR-484水平。研究结果发现预运动训练后骨骼肌分泌大量miR-484前体和miR-484。此外，骨骼肌分泌的外泌体可被神经细胞摄取（图7）。图7 预运动训练脑脊液外泌体miR-484主要来源于骨骼肌为了进一步评估预运动训练是否通过骨骼肌外泌体miR-484发挥神经功能保护作用， 研究团队在大鼠预运动训练前敲低大鼠骨骼肌miR-484表达。研究结果发现敲低骨骼肌miR-484再进行运动训练的大鼠未能促进GPX4和GSH表达以及抑制ACSL表达。此外，敲低骨骼肌miR-484再进行运动训练的大鼠未能改善脑梗死后的神经功能恢复以及减轻脑梗死体积（图8）。图8 骨骼肌miR-484在预运动训练抑制神经细胞铁死亡和改善神经功能恢复中起关键作用运动训练是临床最常用的康复治疗手段之一，目前已经被证实可以促进脑梗死后的神经功能恢复。我们研究团队发现在脑梗死早期神经细胞经历铁死亡，而脑梗死发生前进行预运动训练可以减轻神经细胞铁死亡进而减轻脑梗死的神经功能障碍。该研究结果不仅为治疗脑梗死提供了新的治疗靶点，而且为临床治疗脑梗死提供了新的治疗思路。Preconditioning Exercise Inhibits Neuron Ferroptosis and Ameliorates Brain Ischemia Damage by Skeletal Muscle-derived Exosomes via Regulating miR-484/ACSL4 Axis, Antioxid Redox Signal. 2024 Mar 28. doi: 10.1089/ars.2023.0492. 外泌体资讯网 Antioxid Redox Signal｜中山大学附属第三医院： 预运动训练可通过骨骼肌外泌体减轻神经元脱铁和改善脑缺血损伤
