癌细胞释放细胞外囊泡（EVs）影响其微环境，促进其对细胞外应激的反应。这些EVs包含从其母细胞中选择的组分（蛋白质和核酸），代表了癌症进展的活性生物功能。根据其大小和分子组成，这些EVs是异质的。最近的单个EV检测技术（例如纳米流式细胞术）揭示了EV群体内动态调节的分子多样性，表明复杂的EV异质性超越了经典的生物发生学基础上的EV亚型。这篇综述涵盖了通过新兴的单个EV分析技术发现的EV异质性，这些技术揭示了受致癌转化和化疗影响的EV的复杂分布。对循环单个EV进行精确的分子分析将为深入监测癌症微环境并通过液体活检开辟新的领域。
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细胞外囊泡（EVs）是直径在30纳米到1微米之间的脂质双层颗粒。这些纳米级囊泡从大多数细胞类型释放到细胞外空间和周围生物液体中。因此，EVs存在于所有体液中，包括血液、尿液、眼泪、唾液和脑脊液，并通过调节细胞多种物质的交换在局部和远距离之间进行通信。然而，癌细胞及其肿瘤微环境中的相邻细胞会根据细胞外条件（如缺氧、炎症或治疗应激）动态调节EV的释放。这些分泌的EVs涉及几乎所有恶性进展的方面，例如细胞存活和环境重塑，包括血管网络、血栓形成和炎症调节的生成。EVs的这种多功能性取决于它们复杂的分子组分，例如蛋白质、核酸（mRNA、miRNA、snRNA和DNA）、代谢产物和不同生物发生机制生成的不同EV亚型中的脂质。
表1、EVs和无膜颗粒的亚型分类
每个EV亚型都由具有不同生理特性和组成的单个囊泡组成，尽管它们具有相似的生物发生机制。目前的EV亚型定义可能无法代表单个EV的独特特性和功能。包括CD9、CD63和CD81在内的四跨膜蛋白已被广泛研究为富集在EVs中的经典标记物。最初，人们认为这些四跨膜蛋白共存于从细胞中释放的EV中。然而，许多研究表明，不同的四跨膜蛋白组合（例如仅CD63和同时CD63和CD9）可以在单个EV中找到，而不是全部共存于单个EV中。重要的是，最近的单个EV分析技术，例如超分辨率显微镜下的单个囊泡成像或纳米流式细胞术检测，揭示了由细胞分泌的抗原定义的单个EV的异质混合物。这些证据表明，细胞产生了一系列具有不同表面抗原装饰的独特EV。尽管这些EV亚型在分子组成上似乎部分重叠，但它们独特的组合使其具有独特的功能和靶向特异性。
癌细胞不仅主动释放多种类型的EVs，还增加了总EVs的数量。这些来自癌细胞的EV的复杂性在很大程度上受到内部致癌突变的影响，包括EGFR、HER2、AKT、SRC和RAS。此外，癌细胞根据治疗应激（例如化疗）调节其EV的释放，以实现生存和抗药性。这些受到癌症进展和化疗影响的EV的变化已被视为癌症诊断和预后的强有力的生物标志物。此外，化疗药物的治疗诱导EV的释放，导致转移和亚型变化。因此，对循环EV异质性的检查可以为癌症患者的治疗反应提供直接信息，包括治疗抵抗性。该综述总结了经典的EV亚型和单个EV分析揭示的其他亚型，并概述了目前分析循环EV亚型的单个囊泡水平及其在癌症进展和化疗过程中的亚型变化的方法。
外泌体的经典亚型：微泡和外泌体
根据其生物发生机制，主要的EV类别被分为微泡和外泌体。较小的EV，即外泌体，直径范围从30到150纳米，起源于内吞体多囊体。多囊体与质膜融合，导致内腔囊泡释放到细胞外空间。外泌体富含特定的蛋白质，包括ALIX、TSG101和syntenin-1（SDCBP）。这些蛋白质与内吞体分选复合物（ESCRT）机制有关，用于生成内腔囊泡，并伴随着泛素化的货物在MVB中的内腔囊泡中进行分选。微泡是较大的EV，直径范围从100到1,000纳米，通过从质膜出芽而释放出来。与外泌体相比，微泡的生物发生机制尚未得到很好的解决，但它们的释放似乎与信号通路的激活有关。
图1、EV生物合成和异质性。癌细胞一起释放微泡、外泌体和无膜颗粒。然而，就单个EV的分子组成而言，它们的复杂性要大得多。致癌转化影响与肿瘤微环境中肿瘤侵袭性和功能相关的个体EV表型的变化。
EVs的异质性和亚型
EVs在高离心力下沉淀，外泌体为100,000×g，微泡为10,000×g，并在1.11–1.19 g/L蔗糖或碘二醇梯度的特定密度上浮。基于EV的这些独特特性，先前的研究已广泛讨论了其基于大小和密度的亚型。
图2、分离EV亚型的方法概览。差速离心机和密度梯度超速离心机因其独特的密度而广泛应用于外泌体和胞外体（微泡）的富集。分子大小排阻层析有效地根据尺寸划分EV。免疫亲和纯化和最新的EV分选技术能够富集特定抗原阳性的EV。
分别沉淀在10,000和100,000×g的微泡和外泌体亚型之间存在蛋白质差异。尽管这种分离显示了两个群体之间明显的大小差异，但蛋白质组成彼此重叠。部分内吞体相关蛋白，如EHDs和syntenin-1，在外泌体亚群中相对富集，但细胞骨架蛋白，包括actinins，在微泡中富集。小型EV主要由富含质膜、内吞体和与ESCRT相关的蛋白质的外泌体亚群组成，但缺乏其他亚细胞器蛋白质。
尽管这些基于EV大小和密度的亚分离方法有效地将EV与非囊泡污染物（如蛋白质聚集体或非膜颗粒）分离开来，但其由均一分子组成定义的亚群仍然彼此重叠，暗示EV的分子异质性在这些分离过程中更加复杂。我们对EV的预期多样性是通过OMICS分析中识别的分子数量推断出来的。例如，EV蛋白质组学分析通常从存活且相对均匀培养的癌细胞中揭示了1,000–3,000个不同的蛋白质。如果外泌体的直径约为100纳米，那么只有几百个膜蛋白，而细胞突触囊泡，接近外泌体大小，可能在单个囊泡中包含大约200个蛋白质。如果根据这个数据进行估算，细胞释放了数百种不同的具有非重叠蛋白质组成的EV亚型。
单EV分析的当前进展
尽管EV亚型混合物的分离及其功能研究为我们提供了有价值的生物学知识，但越来越多的证据表明，EV内部的异质性要复杂得多。最近，通过先进的分离方法，如非对称流场流分离技术、流式细胞术中的荧光激活囊泡分选（FAVS）和声学微流控技术，已经可以获得EV亚群。此外，单个EV的物理特性被应用于使用表面等离子体共振和拉曼光谱高灵敏度地检测携带抗原的EV亚群。此外，通过基于抗体的高通量方法（例如改进的ELISA和免疫捕获测定）、基于阵列的EV检测技术和多参数芯片微流控技术实现了监测抗原阳性EV的相对定量。
由于其亚微米大小，尤其是外泌体亚群的直径≤100纳米，EVs低于大多数标准光学成像方法的检测阈值（例如共聚焦显微镜中的约250纳米）。因此，它们的个体特性和多样性长期以来一直难以捉摸。随后，几种用于计数和测量EV的技术，如电子显微镜（EM）、原子力显微镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和可调谐电阻脉冲传感（TRPS），能够表征单个EV。通常，透射电子显微镜（TEM）和冷冻电子显微镜（cryo-EM）被视为直接观察EV分布的黄金标准技术，用于验证其他间接测量和表征方法。
然而，超分辨率成像和电子显微技术在单个囊泡水平的高通量定量方面并不可用，而电子显微镜方法在技术上存在不一致性。基于NTA、DLS和TRPS的方法可以有效地定量测量EV的浓度和大小信息。然而，这些方法不适用于携带特定抗原EV的亚群的定量。NTA可以提供荧光模式，以检测由荧光化学品或抗体标记的特定EV亚型，但由于光漂白，其长时间记录使得记录稳定的荧光阳性粒子运动变得困难。令人印象深刻的是，最近的先进技术能够使用超分辨率显微镜、成像流式细胞术、高分辨率流式细胞术、干涉成像和芯片上的单个EV捕获平台对单个EV进行分子表型分析。即使从单个细胞系中释放，这些对单个EV的高通量分析也能解码EV的异质性和广泛的分子谱。
单个EV的纳米流式细胞术分析
纳米流式细胞术，也称为高分辨率流式细胞术，取得了显著进展，使得我们能够检测到单个EV并获取多个参数（例如大小和分子组成），并具有高灵敏度。为了检测和解析亚微米级别的EV，这些仪器采用了一些改进措施，例如高灵敏度的光电倍增管探测器、雪崩光电二极管探测器、荧光触发、独特角度的光散射检测、用于侧向散射的低波长激光以及软件改进。特别是低波长激光，例如紫色激光（405 nm），在侧向散射中对小（100–500 nm）颗粒的灵敏度和分辨率优于广泛使用的蓝色激光（488 nm）。这种用于单个EV检测的纳米流式细胞术分析基于表面蛋白的非均匀EV亚群。每个EV表面抗原分布的显著差异在EV生物标志物应用的背景下具有重要意义，其中每个EV的分子环境都装备有有关其来源的肿瘤或宿主细胞的有价值的独特诊断信息，以及EV的靶向特异性和功能性。因此，生物体液中包含了来自不同细胞的不同物理和分子特性的多样EV亚型的差异性属性。
表2、通过纳米流式细胞术鉴定EV亚型。
纳米流式细胞术揭示了与疾病相关的血液中的EV亚型，其中大部分EV来源于血小板、红细胞、白细胞和血管内皮细胞。血浆中EV亚型的构成受到病理条件（如癌症）的影响。癌细胞来源的EV亚群比其他血细胞来源的EV亚群更少，但受到癌症状态的显著调节。例如，CD147阳性的EV在结直肠癌患者的血液中显著上调，而STEAP1阳性的EV在前列腺癌患者的血浆中显著增加。因此，通过抗原定义的癌症特异性EV亚型的选择性分析比异质的EV提供了更精确的癌症诊断信息。
尽管纳米流式细胞术是一种强大的工具，可以提供有关单个EV分布的信息，但它存在一些限制，需要克服其对近100纳米或更小尺寸EV的高灵敏度所产生的噪音信号。为了区分EV信号和背景噪音，广泛使用荧光标记EV，例如脂质膜染料、附着于磷脂酰丝氨酸的annexin V、特定表面抗原的抗体、荧光融合膜蛋白和化学染料。特别是，草酰荧光琥珀酰亚胺酯（CFSE）易于用于标记几乎所有EV。这种化学染料是一种非荧光化合物，可以轻松地通过膜扩散到EV的腔侧，然后被囊内酯酶水解，生成高度荧光化合物。此外，在转变为荧光形式后，它与游离胺基团耦合在一起，从而在EV内部稳定保留荧光信号。此外，荧光偶联的抗体用于检测大量EV中的特定亚群。值得注意的是，荧光染料的亮度对于单个EV的检测很重要，因为其表面积较小，只允许将较少的抗体或荧光染料纳入EV中，而不是细胞。因此，应该考虑使用更亮的荧光染料，以更好地区分阴性和阳性EV亚群。不同荧光染料标记方法的组合可用于检测多种分子阳性的EV亚型。例如，DNA含量较高的EV，通过PicoGreen化学染料标记，也是EGFR阳性，而不是CD63阳性。
纳米流式细胞术目前面临的一个挑战是检测直径在30到100纳米之间的较小外泌体（exosomal EVs）。Beckman CytoFLEX可以通过基于紫外激光的侧向散射（violetSSC）解析直径70纳米的聚苯乙烯纳米颗粒。商业上可用的每种纳米流式细胞术都已经证明了对直径超过100纳米的EV进行足够的测量，但在分析较小尺寸的EV时存在准确检测和精确免疫表型的局限性。此外，在高速事件采集过程中，多个较小的EV可能在单个事件中被检测到，并伴随着增加的荧光强度，这被称为“群集效应”。为了在纳米流式细胞术中最小化单个EV检测的群集效应，需要通过多个稀释样品进行精确校准，以找到用于精确测量孤立EV或直接测量复杂生物体液（如血液）中EV/颗粒的最佳浓度。
纳米流式细胞术在细胞外囊泡（EVs）分析中具有许多优势，包括：
- 检测下限更低：纳米流式检测仪的检测范围在7到1000纳米之间，检测只需2到3分钟，适合高通量和大规模样品检测。相比之下，传统电镜的检测下限为30纳米，动态光散射（DLS）的检测下限为0.5纳米，且不适用于低浓度样本。
- 单颗粒分辨率更高：纳米流式技术可以实现对亚纳米级别的脂质双层和囊泡内部结构的直接观测，因此可以检测小颗粒的粒径和形态。与冷冻透射电镜（Cryo-TEM）和NTA的检测结果相比，纳米流式技术不仅灵敏度高，而且散射光的分辨率可以媲美冷冻显微镜。
- 测定荧光提供颗粒的功能性信息：纳米流式技术可以在单颗粒水平上分析蛋白标志物，包括单个标志物和两种标志物的同时分析。这对于研究外泌体与疾病之间的关系以及药物研发具有重要意义。
癌症进展过程中EV的亚型变化
癌细胞分泌的EV表面配体触发的受体激活来激活靶细胞信号通路，从而实现集体定向细胞迁移或增殖。恶性转化大规模影响EV的分子成分，例如其生物活性脂质、囊内载荷、受体、ECM蛋白质、核酸和代谢物。EV蛋白质组学研究表明，这些蛋白质组学变化与转移过程、致癌KRAS源性细胞转化和促炎细胞因子TNF-α刺激有关，与癌症进展和转移巢的形成有关。最近的报告表明，来源于癌细胞的EV在其亚型上具有不同的功能。例如，过表达激活性EGFRvIII的胶质瘤细胞，即缺失配体结合域的激活性突变体，会释放携带增加的致癌性EGFR和与侵袭相关的蛋白酶和粘附蛋白的致病性EV亚群。纳米流式细胞术揭示了EGFRvIII过表达的胶质瘤细胞中CD44/BSG双阳性EV的增加，与其母细胞相比，这代表了一种在细胞膜上具有强烈共定位于尖刺状侵袭足的细胞表型。众所周知，通过RAS-RAF-ERK激活的EGFR信号通路刺激了BSG、CD44和EGFR在细胞膜上的聚集，形成了侵袭足。这种结构通过BSG招募MMP14（MT1-MMP）在癌症侵袭中发挥作用。就胶质瘤CD44/BSG双阳性EV的致病效应而言，CD44可以与富含透明质酸的细胞外基质相互作用，而BSG与MMP14可以促进包括层粘连蛋白和胶原蛋白在内的ECM成分的蛋白酶降解，这表明这种EV可能有利于癌症侵袭和转移。特别是，EGFR的激活似乎部分抑制了外泌体的生物发生，导致外泌体CD81和CD82的下调，并激活了微泡EV的释放。
表3、受癌症进展影响的EV亚型。
液体活检是早期诊断癌症转移或复发、疾病进展以及监测治疗反应的有前途的生物标志物来源。此外，基于液体活检的诊断技术在个体化医学中至关重要，因为它提供了作为伴随生物标志物的信息，可以根据患者特定的突变和对药物治疗的观察反应进行个性化调整。在癌症患者的生物体液中观察到了外泌体亚型的变化。卵巢癌患者的恶性腹水中含有增加的EPCAM阳性亚群。然而，来自乳腺癌患者的血浆中CD47阳性亚群减少。此外，胰腺癌Pan02的同基因C57BL/6小鼠肿瘤模型显示，小鼠血浆中CD9阳性EV亚群增加，与肿瘤生长相关。因此，通过微创方法实时分析液体活检中的EV，将取代或补充传统的外科活检方法。
癌症化疗中EV的亚型变化
化疗已广泛应用于大多数癌症的有效治疗。虽然EV释放与化疗之间的关系尚不清楚，但最近的研究揭示了化疗药物（如紫杉醇、顺铂和阿霉素）对EV分泌的动态调节，推动了癌症的生存、侵袭、转移和多药耐药，促进肿瘤的进展。这种治疗性压力导致了EV的分子成分和释放动力学的改变。这些转化后的EV最终在化疗期间排入体内的循环系统。因此，监测这些EV的载荷或释放动力学可以提供有关患者对化疗的肿瘤进展和反应性的信息。
图3、化疗引起的EV亚型变化。(A) 化疗药物如紫杉醇、多西紫杉醇和达克替尼显著改变EV的释放及其分子组成，改变与癌症生存、迁移、转移、耐药性、肿瘤微环境和免疫调节相关的蛋白质和DNA货物。(B) 通过纳米流式细胞术进行的EV分选能够丰富表征EV的特定亚群。与对照组（约18.09%）相比，多西他赛处理的结直肠癌细胞WiDr显示出含有DNA的EV增加（约62.1%）。EV中的DNA由PicoGreen标记。通过CytoFLEX SRT系统（Beckman Coulter）进行的EV分选。
纳米流式细胞术揭示了DNA含量的外泌体（EV）亚群在总EV中的自然特性，对抗EGFR激酶抑制剂达可米替尼对致癌性EGFR的阻断作出反应，显示出具有不同大小和DNA含量的广泛谱的EV的释放。这项研究揭示了只有特定的EV亚群含有DNA，而这种组成受化疗影响，刺激了凋亡性囊泡化途径，并释放了含有管腔染色质的异质性小型EV。然而，特定DNA含量的EV亚型的研究受到了富集DNA含量的EV的有限方法的阻碍。最近的分选技术结合高灵敏度的纳米流式细胞术可以实现DNA含量的EV亚群的富集。这种EV分选器可以富集特定的DNA含量的EV，从而允许进一步分析其特性和功能的单种EV亚型。因此，免疫表型、纳米流式细胞术和特定EV亚型的选择性富集的组合可以应用于解码受不同癌症情况下的化疗影响的癌症微环境中EV的异质性特性。
挑战与总结
虽然癌细胞来源的EVs的分泌量因其进展或化疗压力而升高，但其在生物体液中的相对组成比其他主要正常细胞来源的EVs（包括血细胞、血小板和内皮细胞）要低。此外，其他非囊泡成分，包括脂蛋白、蛋白聚集体和其他非EV颗粒，由于其相似的大小或密度，难以检测到癌特异性EV亚型。这个重大挑战可以通过选择性分析EV亚型而不是异质性的EVs混合物来解决。EV的亲和分离提供了一种有前途的富集策略，可以使用表面囊泡标记物（如EpCAM或EGFR）来处理特定的EV亚群。
EVs在恶性癌症进展的发病机制和化疗反应性中扮演着越来越重要的角色。它们已被认为是液体活检和诊断应用中的一个有能力的资源，已经获得了在人类癌症中使用的批准。如上所述，传统的总体EV分析存在相当大的内在局限性，难以理解EV的功能、摄取和诊断潜力。这些挑战已经通过单个EV分析得到了重新解决，例如纳米流式细胞术等。这些新技术能够在各种病理生理条件下，特别是在癌症中，揭示EV群体内动态调节的EV特征。
参考文献：Lee, Yoon-Jin, Shinwon Chae, and Dongsic Choi. "Monitoring of single extracellular vesicle heterogeneity in cancer progression and therapy." Frontiers in Oncology 13 (2023): 1256585.细胞外囊泡异质性的解决方案——纳米流式细胞术技术讲座流动的纳米视界：利用流式细胞术深入探索细胞外囊泡讲座时间：4月25日下午02：00讲师简介：
王金丽 | 贝克曼库尔特生命科学 高级应用专家
负责流式细胞仪的应用开发，技术支持等工作。熟悉肿瘤免疫，细胞生物学，生物制药等领域的前沿进展，并且在流式分析分选，多色方案设计方面具有卓越的技能。作为贝克曼的应用专家，她在流式仪器及应用方面具有优秀的技术实力，她能够根据客户的实验需要和设计要求，提供定制化的实验方案，并协助客户优化实验条件，提高实验结果的可靠性和精准性。
讲座简介：
在生物医学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的研究至关重要，它们在理解细胞间通信及其在疾病发生中的作用方面扮演了关键角色。
本次讲座将深入探讨流式细胞术相较于传统分析方法在细胞外囊泡研究中的独特优势。
主要内容包括：
- 方法学比较： 探讨各类EV分析方法学的优缺点，帮助科研人员根据实际需求选择最合适的技术
- EV流式分析与分选： 讲解如何利用流式细胞技术进行高通量、高灵敏度的单颗粒分析，以及如何精确分选并研究目标EV亚型
- 实际应用展示： 展示流式细胞术在细胞外囊泡研究中的具体应用实例，包括如何助力科研人员在生物标志物的发现、疾病诊断和治疗策略的开发中取得突破
- 实验设计与优化： 提供如何优化实验设计和数据解析的策略，以及如何通过这些技术提升研究的质量和效率
外泌体资讯网 单EV分析对于癌症进展和治疗反应监测的重要性
