人体骨骼肌肉系统，又称运动系统，由全身骨骼、软骨、韧带、肌腱、关节、肌肉及结缔组织等器官组合而成，由于退行性改变、代谢紊乱、机械损伤等原因，易导致导致骨肌系统发生病变，常见有骨关节炎、骨质疏松等退行性疾病。目前，传统的药物或手术治疗以及近年来兴起的细胞疗法在骨骼肌肉系统疾病仍具有一定的局限性，需要创新策略。
研究发现，移植细胞可释放细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）等分泌因子发挥治疗作用，这使得拥有更低免疫原性以及更便于生产的EV等无细胞疗法兴起。已有部分人类源性EV被证明能够被关节衍生细胞摄取，并发挥其调节免疫反应，恢复细胞迁移和活化，延缓细胞衰老诱导等作用。植物细胞外囊泡（Plant-derived extracellular vesicles，PDEV），是由植物细胞分泌的普遍存在的一类直径在200nm以内的小分子纳米物质，不仅能作为信息传递的载体，调节植物自身的免疫防御机制及代谢，也能够调节真菌细胞、动物细胞的活性，实现种间细胞交流。相比动物细胞来源的外泌体囊泡和化学合成的纳米载体，PDEV具有的更高的生物相容性、稳定性和较少的生物毒性等副作用，且PDEV提取、生产成本更低，原料来源更多，是一种更加可持续、高效的生物制剂。目前的研究中，PDEV已被证明具有良好的抗氧化、抗炎、促进细胞增殖、分化和迁移，减少细胞凋亡、促进血管生成等生物活性。PDEV可以作为一类新型药物，也能作为部分药物递送的纳米载体。具有双重活性PDEV，在生物医学领域有着广阔的发展前景。
近日，浙江中医药大学附属杭州中医院骨伤科潘浩教授团队在国际著名期刊Elsevier子刊Pharmacological Research发表题为‘Advances in the study of plant-derived extracellular vesicles in the skeletal muscle system’的综述(2024 May 3:204:107202)，系统性回顾了植物来源细胞外囊泡（PDEV）的发生途径和生物学特征，以及目前常用的分离纯化及储存方法。并总结了不同来源的PDEV在骨骼肌肉系统疾病中的治疗作用，及PDEV作为药物载体工程的应用，旨在进一步探索PDEV在骨骼肌肉系统领域中的意义与潜在作用。
在这篇综述中，研究人员总结了植物细胞外囊泡的命名规则发生途径以及一般特征。目前的PDEV多采用具体来源-囊泡的格式进行独立命名，但因植物原料处理方法、分离方法导致囊泡无法定义的情况。比如细胞结构破坏导致细胞内囊泡的污染，为标准化文献的命名方式，Pinedo M等人提出可使用通用术语“植物EV”代替“外泌体”；如使用破坏性过程或存在非自然释放至细胞外空间的囊泡结构，建议使用“植物衍生纳米囊泡(Plant-derived nanovesicles, PDNV)”对提取的囊泡组分命名。了解植物细胞外囊泡的发生途径对其表征具有重要作用。目前的研究认为，植物细胞外泌体主要有三种发生途径：多囊泡体(multivesicular bodies , MVB)途径，双层膜结构的球形细胞器(Exocyst positive organelles, EXPO)途径以及液泡途径(图1)。微囊泡的形成途径与多泡体生物脱落引发的磷脂的重新分配和细胞骨架蛋白的收缩有关，而由凋亡细胞的产生凋亡小体，较外泌体和微囊泡而言具有较大的直径，且拥有更多的细胞内成分，如完整的细胞器、组蛋白、染色质等。
图1 以外泌体为例，阐明植物PDEV的基本形态、成分及释放机制。植物细胞通过以下途径分泌细胞外囊泡(EV)来对抗细菌、真菌和其他病原体的入侵。途径(a)描述了MVB与质膜的融合，导致腔内囊泡(ILVs)作为外泌体释放。途径(b)描述了通过空泡与质膜融合释放腔内EV (IEV)。途径(c)显示EXPO分泌。
缩写:MVB，多泡体;内质网;TNG，跨高尔基网络;EXPO，胞囊阳性细胞器。
PDEV的提取工艺不同于从动物身上提取EV的方法。不同植物来源以及植物不同部位对PDEV的提取效率均有影响。且压榨、切割等预处理方法容易增加细胞内容物污染。当利用叶片和其他植物成分作为原料时，建议选择纯净的质外体洗涤液（Apoplastic washing fluid，AWF）作为首选分离材料。AWF可以使用真空渗透离心机(VIC)方法获得(具体操作过程如图2所示)，有效避免叶片细胞受到破坏，并产生纯度更高的PDEV。而使用无菌培养的植物愈伤组织作为提取PDEV的原料，也能够减轻杀虫剂、杀虫剂和感染等因素造成的潜在污染并有助于保护濒危植物物种。
图 2. 利用真空浸润离心(VIC)方法从茎切叶片中分离AWF(以拟南芥为例)，并采用差速离心分离不同相获得PDEV。(a). 用剪刀剪去叶柄。(b). 用蒸馏水冲洗叶片，吸水纸拍干。(c-e). 将叶子包裹在一个60毫升的注射器中，用蒸馏水或其他渗透溶液使注射器饱和。密封注射器尖端，并通过向外拉注射器产生负压。逐渐释放柱塞。在注射器上施加向下的压力以给予正压。重复步骤c-e，直到叶子被完全浸透。(f-g). 提取叶子并使其干燥。用5ml移液管将叶子卷进封口膜膜。将叶子固定在离心管上。4℃下，在1,000×g摆动斗转子内离心10分钟，回收离心后的AWF。(i-l). 采用差速离心技术分离PDNV。整个过程在4℃下进行。程序步骤源自参考文献[46,48]，具体方法和操作细节可在原文中找到。
PDEV被细胞吸收后，通过其内含有的脂质、蛋白质、核酸等成分发挥其调节细胞增殖分化或凋亡，抗氧化应激，抗炎，抗纤维化等作用。PDEV主要作用于成骨细胞谱系、成纤维细胞、软骨细胞等，发挥其调节增殖分化、促进细胞迁移、抗氧化应激、抗炎等作用，以治疗骨骼肌肉系统的损伤。研究人员整理了近几年PDEV治疗骨骼肌肉系统疾病的研究，发现较多研究集中在骨质疏松症等退行性疾病及伤口愈合方面，也有研究发现其对软骨细胞具有修复作用。例如，山药、人参、苹果、李子等来源的PDEV能通过不同机制刺激成骨细胞增殖、分化，或抑制破骨细胞分化以治疗骨质疏松症。而葛根来源的类纳米样囊泡能通过降解肠道微生物群代谢产物三甲胺-N-氧化物（TMAO）来提升自噬，促进人骨间充质干细胞（hBMSCs）的分化和功能，并提出TMAO可作为骨质疏松症的潜在治疗靶点。Yıldırım M等人证明了番茄来源的外泌体样囊泡对软骨细胞具有修复作用。Chen P等人用软骨细胞膜封装的菠菜来源纳米类囊体单元（CM-NTUs）能在自然光下增加细胞内ATP和NADPH水平，改善退化软骨细胞的合成代谢，以改善软骨稳态并防止骨关节炎的病理进展。该研究基于天然光合系统改善代谢治疗退行性疾病，不仅开辟了新的退行性骨病治疗方向，也为生物有机体和复合生物材料的制备和应用提供了更好的理解。枇杷、柠檬、芦荟等来源的PDEV能发挥抗炎、增加细胞迁移、减少细胞凋亡等作用，人参、芦荟、小麦草汁等来源的PDEV还能够促进血管生成、增加血管分支以提供更充足的血运，在伤口愈合方面起到良好的治疗效果。
综上所述，目前已有部分PDEV被证明在骨骼肌肉领域，尤其是骨质疏松症、伤口愈合及血管重建方面有良好的治疗意义，也发现对软骨细胞具有修复作用。遗憾的是，PDEV在骨关节炎、椎间盘退变、骨关节退行性疾病、骨折状况、神经修复等领域的探索仍存在明显的研究空白。关于PDEV作为骨骼肌系统疾病的药物载体的研究仍然缺乏。此外，对PDEV在骨骼肌系统疾病中的应用的研究主要依赖于体外细胞实验和小鼠体内研究。值得注意的是，目前缺乏关于PDEV临床应用的文献。并且鉴于各种给药途径对PDEV疗效的实质性影响，确定针对不同骨骼肌疾病的最佳给药方法仍然是一个需要进一步探索的领域。
参考文献：
Advances in the study of plant-derived extracellular vesicles in the skeletal muscle system, Pharmacol Res. 2024 May 3:204:107202. doi: 10.1016/j.phrs.2024.107202.
外泌体资讯网 Pharmacological Research | 浙江中医药大学附属杭州中医院潘浩:骨骼肌系统中植物源性细胞外小泡的研究进展
