Theranostics｜中国生物研究院和中国科学院过程工程研究所：干细胞来源的EVs对阿尔茨海默病、帕金森病和脑卒中的治疗干预

随着人口老龄化的增加，神经系统疾病的发生率正在逐年上升。最近，干细胞疗法因其方便的来源、侵入性小和定向分化的能力而备受关注。然而，目前还存在一些缺点，例如质量控制不佳、安全评估以及伦理问题。因此，科学家已经开始将注意力从干细胞转移到细胞外囊泡上。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的生物发生过程、独特的结构和特性决定了其携带有干细胞源的多种功能成份，同时具备生物相容性好，易穿越生物障碍和副作用小等优点。此外，干细胞衍生的EVs可以通过工程化改造设计成药物递送载体，以增强治疗效果。

近期，中国生物研究院和中国科学院过程工程研究所研究团队在Theranostics杂志上发表题为“Stem cell-derived extracellular vesicles in the therapeutic intervention of Alzheimer’s Disease, Parkinson’s Disease, and stroke”的论文，主要总结了天然干细胞来源的EVs的功能，回顾了干细胞来源EVs最新的工程化改造技术及其近三年来在阿尔茨海默病、帕金森病和脑卒中（中风）中的应用，并讨论了与干细胞源性EVs的临床翻译相关的挑战和解决方案。第一作者周晚彤，通讯作者是中国生物研究院新材料科学中心实验室主任安文林和中国科学院过程工程研究所副研究员卢治国。

干细胞（Stem cell, SC）是一类具有多种分化潜能、自我复制和自我更新能力的未分化细胞。干细胞疗法代表了一种有前景的治疗策略，其优点包括来源方便、微创、可移植以及在多种诱导环境中进行定向分化的能力，这些特性突显了其在神经治疗领域的潜力。过去几十年的各种研究表明，干细胞移植可以促进神经发生并在损伤后促进神经愈合。然而，干细胞的应用由于质量控制、免疫不相容性、安全性评估和伦理等方面的限制而面临重大挑战。

EVs是由大多数真核细胞和组织类型分泌的双层脂质结构。由于其来源于细胞，其发生过程、结构特性等使其携带有其来源细胞的多种功能成份，并成为这些成份的独特递送载体。干细胞来源的EVs（SC-EVs）与干细胞不同，它们既不复制也不进行不受控制的分裂，从而避免了干细胞使用相关的问题，如肿瘤形成的风险和成功移植的挑战。重要的是，SC-EVs 具有穿越血脑屏障在大脑内产生治疗效果的能力。此外，得益于从母细胞获得的免疫调节特性，SC-EVs 在基于EVs 的纳米载体中相比其他细胞来源的EVs 提高了治疗载荷的寿命和可用性。有研究表明，SC-EVs 有助于实现良好的结果，包括延长治疗效果、刺激免疫系统、增强质量控制以及在-80°C下长期储存。此外，生物医学工程技术还可以进一步优化SC-EVs 的外部和内部，使其能够靶向特定细胞、增强有效穿越BBB并达到特定的治疗效果。令人鼓舞的是，SC-EVs 的治疗效果已在多种神经疾病模型中得到了广泛探索。

各种研究表明， SC-EVs可以在动物中产生有利的结果，包括神经保护、血管生成和保持血脑屏障的完整性、缓解神经炎症等功能（见表2）。

Table 2. Functions of native SC-EVs

 

 这些研究强调了间充质干细胞来源的EVs（MSC-EVs）和神经干细胞来源的EVs（NSC-EVs）在治疗神经系统疾病中的潜在治疗应用。尽管通过不同的机制组合促进神经修复，但两种类型的EVs都提供了类似的治疗效果，包括神经保护、血管生成和保持血脑屏障的完整性、缓解神经炎症等功能。然而，选择最适合特定神经疾病的SC-EVs仍然不确定。虽然一些研究表明，在NSC-EVs和MSC-EVs治疗效果的比较分析中，NSC-EVs可能比MSC-EVs更有效。然而，这些发现不应被解读为表明MSC-EVs本质上不如NSC-EVs。因此，需要进一步的证据和对基础机制的更好理解，以促进这些发现向临床应用的转化。

尽管SC-EVs作为一种治疗策略具有相当大的前景，但仍存在一些缺点，如低靶向效率、治疗效果不一致和产量有限。这些挑战可以通过各种工程生物技术加以解决（见图3）。

 

通过利用工程化改造技术对SC-EVs的表面或内容进行操作和修改，可以增强其靶向识别、生物分布及更有效穿越血脑屏障的能力，从而提升其治疗效果。最终，这将导致更好的治疗结果。SC-EVs在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和脑卒中等方面具有应用价值（见表3）。

 

近十多年来，在探索SC-EVs的生物学特性及其在神经系统疾病中的潜在治疗应用方面取得了重大进展。然而，临床转化过程中仍需克服若干挑战。首先，SC-EVs的异质性受到诸多因素的影响，包括供体和组织来源、细胞组成、培养条件和环境、不同时期的批次、分离和纯化方法以及EVs的储存条件等。供体的健康状况、遗传构成、性别和年龄的差异都会导致这些多样性。此外，不同来源的组织表现出不同的属性，进一步增加了异质性。同样，培养环境显著影响SC-EVs的产量和功能，包括使用人工预处理、各种培养方法和特定的培养条件。不同批次的SC-EVs在表面标记、生物物理特性和内容物方面存在异质性。此外，EV分离和纯化方法的差异以及EV储存条件的变化也会改变SC-EVs的组成。同时，SC-EVs的表征方法和检测技术尚未标准化。因此，建立细胞来源、生产过程和SC-EVs的标准化制备和质控标准至关重要。这种标准化对于减少与SC-EVs变异性相关的副作用以及保证其在治疗应用中的一致性和可重复性是必不可少的。最近的研究阐明了一些已确立的EV物理化学特性，可以使用透射电子显微镜进行EVs的形态学检查，同时可以使用纳米分析仪精确测量粒子大小和颗粒浓度。关于蛋白质含量分析，BCA蛋白质测定试剂盒提供了一种可靠的定量方法。此外，可以通过流式细胞术评估来自母细胞的胞质蛋白质以及特定的EVs标记物如CD9、CD63和CD81的存在和数量。随着EVs分析技术的发展以及对EVs研究和理解的不断深入，有必要为不同干细胞来源EVs建立定量和特异性指标，建立EVs主要成份和对应功效之间的关联，从而明确SC-EVs的关键质量属性、质量标准和放行标准。

其次，SC-EVs的产量在基于EV的治疗和诊断的临床转化中确实是一个重大挑战。确定能够产生高产量且有效的SC-EVs生产和纯化方法至关重要。需要不断优化SC-EVs的分离技术，以优化产量和纯度。最终目标是建立符合现行良好生产规范的标准化和统一的SC-EVs生产过程。干细胞通常在培养皿或培养瓶中培养，这限制了细胞生长的表面积。多层细胞工厂培养过程可以实现干细胞的中等规模扩展和培养。然而，这种方法需要大量的劳动力和空间，而且细胞可能在层间分布不均。因此，使用大规模自动化细胞培养装置实现高度可重复的细胞培养和细胞上清液的收集是必不可少的。生物反应器是大规模生产细胞外囊泡的必备工具，此外它们具备动态监测能力。

在临床转化之前保持SC-EVs的稳定性至关重要。储存的SC-EVs的稳定性受到诸多因素的影响，如储存条件、温度、储存溶液的选择、储存时间和冻融循环的次数。因此，必须将SC-EVs储存在不超过-80°C的环境中，同时避免反复冻融循环或显著的温度波动。

最后，评估基于EVs的治疗的安全性至关重要。在临床前研究和临床试验中必须彻底调查潜在的不良反应、免疫原性和非靶向效应。

参考文献：

Stem cell-derived extracellular vesicles in the therapeutic intervention of Alzheimer’s Disease, Parkinson’s Disease, and stroke. Theranostics. 2024; 14(8): 3358-3384.

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