糖基化修饰（glycosylation）是不同结构的聚糖（glycan）偶联在蛋白质、脂质甚至RNA上的一种普遍存在的修饰方式。在众多的糖基化修饰中，唾液酸化修饰（sialylation）是最为常见和研究最为深入的一种。唾液酸（sialic acid, SA）是一类含羧基的酸性九碳糖，常位于聚糖的末端，其独特的位置使其成为感知胞外环境的“前哨”，不仅是细胞表面展现电负性的主因，也在细胞间互作和病原体感染中扮演关键角色。
与母细胞类似，细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）这些细胞源性的纳米脂膜小泡，其表面也覆盖着一层聚糖。这层聚糖不仅维护了EVs的表面性质，也参与了如细胞摄取、免疫调控及癌症发生等多个过程。然而，尽管EVs相关的蛋白和核酸已被广泛研究，对EVs聚糖的探索仍处于初级阶段。EVs的个体差异性和多样性极高，不同的EVs亚群往往与特定功能紧密相关。因此，在单个颗粒水平对EVs进行表征，对于深入理解其组成和生物学功能至关重要。2024年7月24日，厦门大学化学化工学院颜晓梅教授课题组在Analytical Chemistry在线发表题为“Surface Sialic Acid Detection of Small Extracellular Vesicles at the Single-Particle Level by Nano-Flow Cytometry”的研究论文（Anal. Chem.，2024，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c01763），报道了该团队利用自行研制的纳米流式检测装置（nano-flow cytometer, nFCM）对单个EVs表面唾液酸进行原位标记和分析的方法。第一作者蔡年桂，通讯作者颜晓梅。
受温和偏高碘酸钠氧化联合苯胺催化的肟连接（periodate oxidation and aniline-catalyzed oxime ligation, PAL）策略启发，该研究首先建立了EVs表面唾液酸的特异性化学标记方法PALEV，结合nFCM对粒径低至40 nm的单个EVs侧向散射光（SSC）和荧光（FL）的同时检测能力，进一步实现对单个EVs表面衍生化唾液酸的荧光检测。以人结肠成纤维细胞系CCD-18Co来源EVs为研究模型，实验结果表明，仅在标记条件适宜时，才能对EVs表面唾液酸进行高效标记，其标记比例和常用的凝集素标记相当。需要指出的是，凝集素标记由于其与聚糖的多价结合可能引起EVs的部分聚集，不利于单颗粒分析。 随后，通过SA修饰脂质体、酶去除末端SA残基、凝集素预先阻断、内源性唾液基转移酶抑制剂处理等系列实验对PALEV方法的标记特异性进行了验证，并将该方法应用于多种细胞系来源、唾液来源以及红细胞（red blood cells, RBCs）来源等6种不同EVs表面唾液酸分布情况的单颗粒水平分析，验证了方法的普适性。尽管几乎每一个母细胞表面都被唾液酸修饰，但是由于EVs的表面积仅为细胞的万分之一，单颗粒水平的分析结果表明并不能在这些细胞来源EVs的每一个颗粒的表面检测到唾液酸，不同来源EVs的SA标记比例和标记强度均存在很大不同，揭示EVs表面唾液酸修饰存在极大的异质性和多样性，这也是首次针对EVs表面聚糖异质性的单颗粒水平研究。此外，尽管采用钙离子载体诱导RBCs分泌EVs以用于药物递送已被广为报导，但这一过程是否会引起RBC EVs表面唾液酸化水平的变化仍不清楚。研究人员发现RBC在钙离子载体刺激下不仅会分泌更多EVs，同时表达唾液酸的RBC EVs亚群比例以及单个EVs表面的唾液酸含量均显著增加，这也解释了为何钙离子载体刺激后红细胞表面的唾液酸丰度下降这一现象。综上，该研究构建的PALEV方法结合nFCM在单颗粒水平对纳米生物颗粒进行高通量、多参数定量分析的强大能力为EVs的聚糖分析提供了独特的视角。
参考文献：Surface Sialic Acid Detection of Small Extracellular Vesicles at the Single-Particle Level by Nano-Flow Cytometry,Anal Chem. 2024 Aug 6;96(31):12718-12728. doi: 10.1021/acs.analchem.4c01763. Epub 2024 Jul 24.
外泌体资讯网 Analytical Chemistry｜厦门大学颜晓梅教授团队：纳米流式检测技术在单颗粒水平上检测小细胞外囊泡表面的唾液酸
