近年来，PET塑料的酶法解聚循环回收技术已取得重要研究进展，大量高效耐高温的解聚酶已被设计出，但PET解聚酶的强疏水性、细胞毒性等特性导致其重组可溶性表达水平低（豪克级/升），严重阻碍该技术的大规模应用。近日，南京工业大学姜岷/董维亮教授团队在International Journal of Biological Macromolecules上发表了题为“Boosting extracellular FastPETase production in E. coli : A combined approach of cognate chaperones co-expression and vesicle nucleating peptide tag fusion”的论文，提出了一种新的重组表达策略。通过生物信息学分析，将Ideonella sakaiensis 201-F6来源的分子伴侣与PET塑料解聚酶FastPETase在大肠杆菌中进行共表达（同源分子伴侣共表达策略），显著增加了FastPETase 的可溶性表达水平（提高了2.5倍），且效果优于商业化的分子伴侣系列质粒（TaKaRa）。随后，将FastPETase解聚酶与一种新型囊泡成核肽 (VNp) 进行融合表达，成功构建了大肠杆菌分泌表达体系。最终，在5L发酵体系中，通过上述组合策略将FastPETase的分泌表达水平提到了2 g/L，是目前在大肠杆菌底盘中最高的生产水平。同时，发酵上清中的FastPETase粗酶液表现出与纯酶相当的PET塑料降解效果，可直接用于PET塑料的酶法解聚。该项工作不仅为分子伴侣在蛋白质折叠中的作用提供了新的认识，而且为蛋白质的异源重组表达优化提供了一种有效的新策略。论文第一作者为南京工业大学硕士研究生吴婷，通讯作者为南京工业大学周杰副教授。
团队首先考察研究了商业化分子伴侣质粒（TaKaRa）对FastPETase可溶性重组表达的影响，商业伴侣质粒的共表达仅导致可溶性 FastPETase 产量略有增加，但从I.sakaiensis 201-F6 中克隆了的同源伴侣基因，特别是与 DnaJ 和 DnaK 共表达时FastPETase的可溶性表达有显著提升（酶活分别提升2.4和2.1倍）（图1和2）。图1 使用商业化分子伴侣共表达对FastPETase可溶性表达的影响图2 大阪菌201-F6来源同源分子伴侣对FastPETase 可溶性表达的影响团队进一步研究了同源DnaK-DnaJ 组合分子伴侣共表达对FastPETase 可溶性表达的影响，结果显示同源 DnaK-DnaJ 组合伴侣进一步增加了 FastPETase可溶性表达（酶活提升2.9倍），并优于对照组FastPETase与商业化的组合分子伴侣（pGTf2）（酶活提升1.8倍）(图3)。图3 包含组合同源分子伴侣的FastPETase的可溶性表达和活性分析此前，塑料解聚酶FastPETase在不同表达宿主中的重组分泌表达水平都偏低。英国肯特大学的Daniel P. Mulvihill教授团队介绍了一种利用囊泡成核肽VNp促进异源蛋白质在大肠杆菌中分泌表达的技术。团队将该技术进一步用于塑料解聚酶FastPETase的大肠杆菌分泌表达体系的构建。结果显示，以囊泡成核肽VNp6（有利于低温诱导条件）作为工具可以有效促进FastPETase在大肠杆菌中分泌表达，结果显示了大约85%的FastPETase被分泌到培养物上清液中，突出了VNp6 标签在促进大肠杆菌中 FastPETase 可溶性分泌方面的有效性（图4）。图4 FastPETase的大肠杆菌分泌表达体系的构建最后，团队基于上述的结果，进一步将基于囊泡成核肽VNp6分泌表达与同源分子伴侣共表达策略进行组合，在5-L发酵罐体系，采用分批补料技术，将FastPETase的分泌表达水平提到了2 g/L，是目前在大肠杆菌底盘中最高的生产水平。证明了组合同源分子伴侣和囊泡成核肽融合策略对于增强 FastPETase重组分泌表达的显著作用（图5）。图5 VNp6-FastPETase在5-L发酵罐体系的发酵产酶该工作证实，同源分子伴侣在促进蛋白质异源可溶性表达方面具有一定的优势，表明分子伴侣与目的蛋白之间具有配对特异性。这个现象类似于输血中也需要匹配血型，因此精确的分子伴侣组合共表达对于成功的重组蛋白表达和功能至关重要。此外，囊泡成核肽VNp在促进目的蛋白分泌方面效果显著由于传统的信号肽，实现了FastPETase的高效分泌表达，证明这种技术方法具有更广泛应用的潜力。Boosting extracellular FastPETase production in E. coli: A combined approach of cognate chaperones co-expression and vesicle nucleating peptide tag fusion, Int J Biol Macromol. 2024 Nov 19;283(Pt 3):137857. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2024.137857.https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813024086677外泌体资讯网 Int J Biol Macromol｜南京工业大学姜岷/董维亮：提高PET塑料解聚酶在大肠杆菌中分泌表达水平的新策略
