细胞外囊泡（EVs）高度异质，不同来源亚群具有特异性功能。附睾小体是附睾分泌的EV，在精子成熟中起关键作用，但获取困难。近日，来自华中科技大学的李红钢、丁晓芳团队合作在J Extracell Vesicles杂志发表文章，首次利用流式细胞术分离人类精液中的CD63阳性附睾小体，并鉴定CD52为附睾特异性标志物。结果显示，该亚群在改善精子功能方面优于其他精液EV亚群，展示了其在男性生殖研究及临床应用中的潜力。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一种由磷脂双分子层包裹的纳米级颗粒，广泛参与细胞间通信以及多种生理和病理过程的调控。目前研究表明，EVs由不同的亚群组成，这些亚群携带来源细胞的特定货物，能够反映母细胞的状态并向受体细胞传递信息。不同来源的EV亚群具有各自特定的生物学功能。然而，由于实验室制备的EV通常是混合物，难以清晰理解各亚群的具体功能特性。近年来，将EVs用作疾病诊断标志物的研究取得了显著进展。研究发现，疾病状态下EV的组成和功能会发生显著变化。例如，癌症微环境中由正常细胞和异质细胞群产生的EV存在差异；炎症细胞所产生的EV货物也与正常细胞不同。这些现象表明，异常来源的EV亚群需要与正常EV分离，以便深入研究疾病机制。同样，对于只能从复杂体液中获取样本的疾病，分离特定EV亚群可能成为一种非侵入性的诊断工具，用于确定感染的类型和位置。因此，开发一种能够分离不同来源EV亚群的方法至关重要。目前，常用的EV分离方法包括差速超速离心（dUC）、尺寸排阻色谱（SEC）和聚合物介导沉淀等。这些方法仅能分离总的EV群体，而无法评估EV亚群间的差异性。近年来，基于Iodixanol/Optiprep梯度和蔗糖梯度的分离方法开始出现，这些方法主要依据EV的尺寸和密度进行分离。然而，组织或细胞特异性EV亚群的物理特性通常十分相似，如何有效分离这些亚群仍然是一个挑战。基于不同来源EV亚群在特定蛋白表达上的差异，免疫亲和法提供了一种高特异性捕获目标EV亚群的可能性。随着技术的进步，传统流式细胞术的分辨率和灵敏度显著提高，不仅能用于细胞检测，还可应用于纳米颗粒的检测。然而，流式细胞术在EV分选中的应用仍面临诸多限制，例如缺乏明确的亚群特异性标志物、如何表征和验证每种EV亚群的独特组成、如何提高目标EV亚群的浓度以满足后续实验需要。此外，还有一些技术问题需要解决，包括如何提高纳米颗粒的检测灵敏度、如何应对“聚集”现象、如何克服多抗体引起的空间位阻，以及如何准确分离阳性和阴性群体。在男性生殖领域，精子因其转录和翻译功能处于静止状态，依赖附睾微环境完成成熟过程。附睾小体（Epididymosomes）是附睾上皮分泌的EVs，是附睾微环境的重要组成部分。研究表明，附睾小体通过向精子传递蛋白质和脂质，赋予精子受精能力，这是其主要作用机制。近年来，附睾小体的重要性逐渐受到重视。研究发现，附睾小体中的小非编码RNA（sncRNAs）会受到环境因素的影响，并传递至精子中，作为货物在体细胞与生殖细胞间传递信息。这种过程在胚胎发育及后代健康中发挥重要作用，同时也突破了魏斯曼屏障，支持了达尔文的泛生学说。尽管附睾小体在男性生殖中的重要性已经得到一定认可，但目前针对附睾小体的可靠人类研究仍然有限。这主要是因为获取附睾组织和附睾液非常困难，尤其是在没有前列腺或精囊腺液的情况下。能够直接从人类精液中分离附睾小体，将为男性生殖领域的研究带来极大助力。此外，附睾小体还可作为一种非侵入性的临床诊断标志物。该研究首次报道了一种基于流式细胞术分选技术分离组织特异性EV亚群的方法。研究中，作者鉴定了一种附睾小体膜表面的附睾特异性蛋白，作为分选标志物。随后，研究团队尝试直接从人类精液中分离附睾小体亚群，并研究了不同精液EV亚群对精子功能的影响。研究重点还包括提高目标附睾小体浓度及验证其功能。综合研究结果表明，如果能够确定特定标志物，该方法还可推广应用于从其他混合物中分离目标EV亚群。这一技术的开发为EV分离和应用研究提供了新的可能性。精液中的细胞外囊泡（EVs）来源复杂，包括附睾、前列腺和精囊腺，其中附睾小体（epididymosomes）在精子成熟中起重要作用，但难以获取。该研究建立了一种基于流式细胞术分选的新策略，用于从人类精液中分离CD63阳性附睾小体。鉴定了CD52作为附睾特异性分选标志物，这是一种仅在附睾中表达的膜定位蛋白。随后，通过流式细胞仪从人类精液中分离并浓缩CD63阳性附睾小体。此外，其他CD63阳性的精液EV亚群相比，分离的CD63阳性附睾小体在改善精子功能方面表现更优。这证明了成功从人类精液中分离出附睾小体亚群。这一方法不仅适用于附睾小体，还可扩展至其他复杂来源的EV分离，为不同EV亚群的功能研究及潜在临床应用奠定了基础。Luo J, Zhu S, Kang Y, Liu X, Tan X, Zhao J, Ding X, Li H. Isolation of CD63-positive epididymosomes from human semen and its application in improving sperm function. J Extracell Vesicles. 2024 Oct;13(10):e70006. doi: 10.1002/jev2.70006. PMID: 39417597; PMCID: PMC11483612.外泌体资讯网 JEV：流式法从精液中分离附睾EVs及其改善精子功能的作用 | 一作讲坛
