无标记(Label-Free)光学成像技术因其无需发光标记，可直接测量样品的本征性质，相比荧光具有独特优势，逐渐成为一种重要的细胞外囊泡(EVs)检测工具，但现有的无标记成像技术通常只局限于测量单个EV的尺寸，难以检测其他物理参数。电化学阻抗谱(EIS)是一种利用电化学手段分析EV的无标记方法，目前已被用于测量单细胞和多个EVs，但实现单EV水平的阻抗成像仍然极具挑战性，主要原因是EV的微小尺寸，以及微弱的电化学信号。鉴于此，浙江大学百人计划研究员马光中和姚波教授合作开发了干涉散射电化学显微镜(iECM)。iECM采用干涉散射（iSCAT）原理，结合电化学阻抗技术，极大地增强了电化学信号的灵敏度，从而实现了单个EV的阻抗成像，为了解其电化学特性提供了独特的视角。iECM允许同时测量EV大小和实时监测EV-抗体结合，这些关键参数能够高精度地区分不同细胞系来源的EVs。值得注意的是，该研究发现EVs的阻抗谱也可以作为特异性指纹来区分来自癌细胞/健康细胞的EVs。随后，研究者通过应用机器学习(Machine Learning)算法，建立了用于EVs表征和分类的独特模型。相关工作以“Label-Free Impedance Imaging of Single Extracellular Vesicles Using Interferometric Electrochemical Microscopy”为题发表在Analytical Chemistry期刊上，论文的第一作者是浙江大学毕业生张元昕（现ASU博士生）和浙江大学硕士生洪子宸。
图 1 干涉散射电化学显微镜(iECM)原理图和检测示意图。通过电化学阻抗和机器学习可以区分不同细胞系来源的EVs首先，研究者建立了干涉电化学显微镜平台，并从细胞系中提取了小细胞外囊泡(sEV)和大细胞外囊泡(lEV)。在对比干涉散射(iSCAT)和荧光成像结果后，可以确认观察到的图像确实为EVs而非杂质干扰。随后，根据iSCAT信号与EV尺寸之间的定量关系，通过标准曲线提取得到单个EV的尺寸信息。测得lEVs和sEVs样品的直径分布分别为177 ± 44 nm和112 ± 20 nm，与NTA的测量结果吻合。图 2 EVs的干涉散射(iSCAT)和阻抗成像。（上方蓝色框）EVs的标准曲线、荧光成像与iSCAT成像对比图。（下方紫色框）通过施加交流电(AC)进行EVs阻抗成像及与iSCAT对比图。作者通过结合EV的电化学模型和iSCAT成像原理，推导了光学信号和阻抗信号的定量关系。该关系可以理解为，在氧化铟锡(ITO)玻片上施加交流电后，其反射率会随电压发生变化。当向玻片上引入EVs时（即EVs接入电路后），EVs的阻抗使得电压减小，进而改变了ITO表面的电荷密度，即改变了其介电常数，引起反射率变化，从而建立起阻抗（电学信号）——反射率（光学信号）的基本关系式。这项工作中的iECM平台既可以通过抗体-EVs膜蛋白结合信号进行抗体标记检测，又支持无标记直接检测EVs的阻抗指纹谱。研究者检测了来自非小细胞肺癌A549、乳腺癌MCF-7和正常乳腺上皮MCF10A细胞系的EVs在25~45Hz范围内的Label-Free阻抗指纹谱；以及三种EVs的表面蛋白(EpCAM、CD63、CD81)和对应抗体结合时的抗体标记信号，观察到EV信号之间存在异质性。图 3 EVs阻抗测量。（左）无标记测量25~45Hz范围内的EVs阻抗指纹谱，及使用随机森林(RF)算法对EVs进行鉴别的混淆矩阵。（右）抗体标记测量EVs三种表面蛋白(EpCAM、CD63、CD81)和对应抗体结合时的信号。随后，作者应用随机森林(RF)和深度神经网络(DNN)算法，对上述无标记/抗体标记的EVs信号数据集进行鉴别。对于抗体标记的EVs数据集，RF能在测试集上以94.5%的准确率区分乳腺癌、肺癌和正常细胞来源的EVs。对于无标记EVs阻抗谱，RF和DNN区分EVs的准确率都在80~90%之间。图 4 使用机器学习进行EVs分类。用随机森林和深度神经网络算法对抗体标记和无标记阻抗谱进行分类，成功鉴别了来自A549、MCF-7和MCF10A细胞系的EVs。总之，这项研究开发了iECM作为现有Label-Free技术的有力补充。通过iECM技术首次测量了单个EV的阻抗，并在单囊泡水平上评估分子相互作用。该方法基于其独特的电化学特征，利用机器学习区分来自不同类型细胞的EVs，不仅为EVs分类提供了一种新的方法，而且为理解其生物物理特性提供了有价值的视角。Label-Free Impedance Imaging of Single Extracellular Vesicles Using Interferometric Electrochemical Microscopy. Analytical Chemistry. 2024. DOI: 10.1021/acs.analchem.4c04244.外泌体资讯网 Analytical Chemistry | 浙江大学马光中、姚波课题组：用干涉散射电化学显微镜对单个EV进行无标记电阻抗成像
