细胞来源的细胞外囊泡（EVs）在成为生物源基因传递系统的过程，受到相对低效的装载策略的限制。来自瑞士苏黎世联邦理工学院的研究人员将EV与预装载的非层状溶致液晶脂质纳米颗粒（LCNPs）自发杂交，将各种核酸装载到小型EVs中，从而形成杂交EVs（HEVs）。研究表明，EV膜蛋白在HEV表面仍然可接触，其固有的酶活性在杂交过程后未受到影响；重要的是，HEVs在体外显示出比未杂交的LCNPs更高的核酸传递效率。这一多功能平台具有将各种核酸分子装载到原生EVs中的潜力，并可能有助于开发基于EV的治疗方法。相关内容以“Loading of Extracellular Vesicles with Nucleic Acids via Hybridization with Non-Lamellar Liquid Crystalline Lipid Nanoparticles”为题在线发表于2024年12月31日的国际知名综合性学术期刊Advanced Science杂志上。
近年来，RNA治疗，如基于mRNA的疫苗和siRNA药物，受到了越来越多的关注，使得像COVID-19疫苗、patisiran/Onpattro或nusinersen/Spinraza等突破性药物得到批准。虽然寡核苷酸可以通过化学修饰来增强其“药物相似性”，并且通常以裸露形式或与靶向基序（例如N-乙酰半乳糖胺）结合的方式给药，但较大的核酸（NAs），如mRNA，通常需要封装在纳米载体内以促进其细胞内递送。脂质纳米颗粒（LNPs）因其制造简便、高核酸装载效率和良好的安全性而成为临床相关的核酸递送系统。然而，LNP领域目前面临两个阻碍其发展的障碍。一方面，系统注射的LNP缺乏组织特异性靶向，主要在单核吞噬系统（例如肝脏）器官中积累，这在治疗其他组织时需要高剂量的给药。其次，LNP与不必要的免疫反应和重复给药后的加速血液清除有关，这突显了开发更安全和更有效的LNP制剂的必要性。细胞外囊泡（EVs）是自然产生的细胞产生的囊泡，可能为解决LNP的一些局限性提供了有前景的途径。它们通过细胞外空间运输生物分子，如蛋白质和核酸，作为细胞间通信的重要介质。使用EV（例如来自间充质干细胞（MSCs））的临床试验突显了它们良好的耐受性，并且有证据表明，与LNP相比，EV可以更安全和有效地递送核酸。尽管如此，将治疗性核酸有效装载到小型EV（<200 nm）的腔内仍然具有挑战性。对EV生产细胞系的基因操作是将蛋白质或基于核酸的载荷引入EV的广泛使用的方法。然而，当处理从原代细胞或患者衍生的生物液体中获得的原生EV时，这种方法存在局限性，并且仅限于细胞自身可表达的核酸，无法操作化学修饰的核酸。因此，后分离装载方法更具多样性。它们通常通过物理或化学刺激暂时破坏EV膜，包括电穿孔、超声波、挤出、跨膜pH梯度和热震荡。其他策略包括对核酸的疏水性修饰（例如，使用胆固醇）以便附着到EV表面或与其他纳米载体（例如，含有脂质、聚合物或蛋白质材料的复合物或脂质体）相互作用及杂交（例如，Lipofectamine、Exo-Fect和聚乙烯亚胺（PEI））。尽管在EV的外源性装载方面进行了十多年的研究，但缺乏标准化的协议和对工程化EV产品的表征不足阻碍了其临床转化。实际上，有报告称某些外源性装载技术、EV转染试剂和用于纳米载体杂交的材料可能会对EV的物理和功能特性产生负面影响。受到这两个领域现有局限性的激励，研究人员报告了一种EV的外源性装载策略，达成两个主要目标：1）避免使用严苛的机械或化学处理，从而至少部分保留EV的功能和生物特性；2）有效地将核酸封装在EV内。在此背景下，研究人员使用非层状溶致液晶（LLC）脂质纳米颗粒（LCNPs）对原生MSC来源的EV进行转染，载荷包括siRNA、mRNA和RNA适配体。通过单颗粒表征技术，研究人员研究脂质纳米载体的物理化学特性、拓扑结构与其与小型EV融合/聚集倾向之间的相关性。结果显示，非层状脂质中间相通过在生理条件下简单共培养促进了LCNPs与EV之间的有效杂交。LCNP在pH 5时经历从反向六角（HII）相到pH 7.4时更无序的非层状相（可能是反向胶束（L2）或海绵（L3）相）的pH依赖性结构转变，这些相特别适合诱导与EVs的受控杂交过程。这种杂交方法消除了额外共挤出步骤的需要，这可能会损害核酸装载效率并促进EV腔内成分的损失。借助先进的光流体平台，研究证明MSC-EV膜蛋白位于形成的杂交EV（HEV）颗粒的表面，其固有的酶活性在过程中未发生改变。这代表了与基于电荷的杂交反应相比，HEV产品质量的显著改善，后者使用的永久带电阳离子脂质可能会对EV的物理化学特性和生物活性产生不利影响。最后，研究表明，最先进的单颗粒分析技术揭示，LCNPs在生理条件下与各种EV亚群体相互作用，并且约40%的HEVs装载了遗传物质。与EV的杂交可以提高siRNA和mRNA装载的LCNP的敲除或表达效率，特别是在具有挑战性的细胞培养条件下。参考文献：Loading of Extracellular Vesicles with Nucleic Acids via Hybridization with Non-Lamellar Liquid Crystalline Lipid Nanoparticles. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 31:e2404860.
