细胞外囊泡（EVs）是一类由细胞分泌的纳米级囊泡，携带包括microRNA（miRNA）在内的生物分子，在细胞间通讯、疾病进展和药物耐药性中发挥关键作用。然而，由于EVs具有高度异质性，且平均每个囊泡中的miRNA含量少于一个拷贝数，传统检测方法难以在不破坏EV结构的前提下实现单个miRNA拷贝数的精准定量，这严重制约了对其功能机制的深入理解。
近期，中国科学院杭州医学研究所/化学研究所方晓红研究员团队报道了一种基于DNA四面体探针的单分子荧光成像技术，实现了单个EVs内miRNA拷贝数的超灵敏定量分析，并揭示了miRNA在EVs中的分布规律。该研究以“Ultrasensitive Quantification of microRNA Copy Number in Individual Extracellular Vesicles Using DNA Tetrahedron-Based Single-Molecule Imaging”为题发表在Analytical Chemistry上。中国科学院化学研究所博士研究生刘维凤和杨宏伟(现为中国科学院理化技术研究所博士后）为论文第一作者，通讯作者是中国科学院杭州医学研究所/化学研究所方晓红研究员和中国科学院化学研究所张振博士。
作者设计了一种基于DNA四面体的荧光探针（DTD），其结构由四条单链DNA自组装而成，修饰荧光基团（Cy5）和淬灭基团（BHQ-3）。当探针识别目标miRNA时，Cy5与淬灭基团分离，触发荧光信号。作者首先利用标准脂质体系统并结合全内反射荧光显微镜（TIRFM）对miRNA的拷贝数进行定量分析。通过精确控制脂质体中目标序列的数量，实现了对不同拷贝数miRNA的模拟，进一步验证了DTD探针能够准确定量脂质体里已知拷贝数的miRNA。该探针能够以高达70%的效率穿透EVs，且不破坏其结构，在TIRFM下，首次实现了单个EV单拷贝miRNA的原位检测，通过对不同细胞系来源的EVs进行统计分析，揭示了miRNA的分布模式呈现出低占有率和不均匀分布的特点。进一步对耐药肿瘤细胞的研究中，发现耐药细胞通过增加单个囊泡中耐药相关 miRNA 的拷贝数来增加miRNA含量，这一发现为理解EVs在肿瘤耐药中的作用机制提供了新的视角。
图1：DNA四面体探针原位检测单个EV中miRNA的原理示意图
图2：（A-C）验证DTD的成功合成，验证其特异性并表征EVs；（D-E）基于DTD的单分子成像技术实现EVs中miRNA的原位成像
图3：（A）标准化脂质体系统用于定量靶标分子拷贝数的示意图；（B）脂质体中DTD的TIRF成像；（C-F）脂质体中装载不同数量耙标分子的DTD的单分子成像数据分析
图4：（A）不同细胞系来源EVs的TIRF图像；（B-C）miRNA与EVs共定位比例统计分析和拷贝数的分布情况。（D）描述不同细胞系EVs中miRNA低占有率和分布不均的模型示意图。
图5：（A）耐药前后肿瘤细胞EVs的TIRF成像；（B-C）耐药前后A2780细胞中EVs miRNA拷贝数的分布；（D）耐药前后A2780细胞中EVs与miRNA的共定位比例。
综上所述，作者基于DNA四面体探针的超灵敏单分子成像技术能够检测和定量来自不同细胞来源的单个EV中的miRNA拷贝数（甚至可以检测到单拷贝），且无需信号放大。更重要的是，发现了EVs中miRNA的一种新分布模式，即只有少数囊泡含有分布不均的miRNA。此外，将这项技术应用于耐药细胞的研究，揭示了细胞耐药前后的一种新分泌模式，为研究EVs介导的细胞耐药性提供了新依据。这项技术为研究EVs的生物学功能和EVs miRNA介导的细胞间通讯提供了重要工具。
参考文献：
Ultrasensitive Quantification of microRNA Copy Number in Individual Extracellular Vesicles Using DNA Tetrahedron-Based Single-Molecule Imaging, Analytical Chemistry, 2025 (DOI: 10.1021/acs.analchem.4c07068.)
外泌体资讯网 Anal Chem｜中国科学院方晓红：基于DNA四面体的单分子成像技术超灵敏定量单个细胞外囊泡中的MicroRNA拷贝数
