肝癌是全球致死率第二高的癌症，现有诊断主要依赖影像学手段，存在准确性不足等问题。外泌体作为新兴的癌症诊断工具，因其广泛存在于血液、唾液、尿液等体液中，且能够稳定携带细胞特有的蛋白、核酸等，成为潜力巨大的生物标志物。外泌体源性microRNA（miRNA）在体液中的含量较高，具有良好的稳定性和诊断特异性，能有效克服传统样本的降解问题。然而，现有的相关诊断技术在灵敏度、操作复杂性和成本方面存在瓶颈，亟需优化和突破，以推动外泌体源性miRNA在肝癌早期诊断中的应用。
为此，暨南大学生命科学技术学院肖珩副教授、张其威教授，广东省第二人民医院曹冬林教授团队联合开发了一种基于引物交换反应级联RNA转录的室温荧光生物传感器，可实现室温下外泌体源性miR-21的高效、高特异性灵敏检测，有望为肝癌的早期快速诊断提供便携、经济且可靠的技术支持。相关工作以“Primer Exchange Reaction with Cascade RNA Transcription for Highly Specific Detection of Exosomal miRNA and Liver Cancer Diagnosis”为题发表在Analytical chemistry杂志上（doi/10.1021/acs.analchem.4c06517）。文章第一作者为暨南大学硕士生赖彦明、广东省第二人民医院肖威博士和广州医科大学附属清远医院雷志伟博士。
一、原理示意图
PERFECT技术用于检测外泌体源性miRNA的策略如图1所示。该检测策略主要包括三个步骤：（1）目标miRNA解锁发夹探针；（2）引物交换反应（PER）扩增；（3）PER扩增产物触发RNA适配体转录并产生荧光信号。 如图1B所示，当目标miRNA存在时，它与被锁定的发夹（HL）的保护序列结合，并将HL转化为未锁定的发夹（HP），允许引物与之结合。在Bst DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物不断发生“延伸——停止——链置换”的过程，产生了大量的PER扩增产物，即转录触发器。随后，这些触发器与转录模板链结合，通过T7 RNA聚合酶启动转录反应，从而产生大量的Spinach RNA适配体。最后，DFHBI与Spinach RNA适配体结合，产生强烈的荧光信号响应。
图1. PERFECT技术原理示意图
二、灵敏度测试
以miR-21为例， 在最佳实验条件下，对不同浓度的miR-21进行检测以评估该方法的灵敏度。荧光光谱如图2 A所示，表明了miR-21浓度与荧光强度之间的同步增加关系。如图2B所示，PERFECT检测的荧光强度随miR-21浓度增加而增加，并在miR-21浓度为50 nM 时达到稳定。在1 fM至100 pM范围内，miR-21浓度与荧光强度呈良好的线性关系（图2C），确定37°C 下PERFECT检测miR-21的最小检测限度（LOD）为2.2 fM。 此外，我们还分析了 25 °C 下 PERFECT 测定的灵敏度，其检测miR-21的LOD 评估为 2.7 fM。紫外灯下拍摄的实际照片如图2D所示，随着miR-21浓度的增加，反应体系的荧光强度由弱变强。这些实验结果都说明了PERFECT技术对靶标miRNA具有很好的检测能力、灵敏度高。
图2. PERFECT技术的灵敏度检测结果
三、选择性测试
准确区分 miRNA 家族的不同成员对于精确的癌症诊断至关重要。然而，由于 miRNA 序列的高度相似，这仍然相当具有挑战性。为了评估PERFECT系统的选择性，我们使用各种 miRNA 进行了实验。与 miR-21 相比，这些非靶标序列均未产生明显的荧光反应（图 3A）。紫外光下的可视化结果进一步证实了这种选择性（图 3B），表明该方法对 miRNA 表现出高度特异性。
图3. PERFECT技术的特异性检测结果
四、细胞样品实验
接下来，我们从不同细胞系（正常肝细胞L-O2、宫颈癌细胞Hela 和 肝癌细胞HepG2）中提取总 RNA或从上清液中提取细胞外泌体源性RNA，检测其中 miR-21 的水平。透射电子显微镜（TEM）确认提取的外泌体具有典型结构（图 4A），纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示外泌体大小主要集中在 150 nm，浓度为 3.84 × 10⁸颗粒/mL（图 4B）。定量分析表明，miR-21在不同细胞系中的表达水平存在差异，L-O2 细胞的 miR-21 水平显著低于 Hela 和 HepG2 细胞（图 4C），与 RT-qPCR 结果一致。如图 5D 所示，PERFECT 技术测定显示 HepG2 细胞中的外泌体源性miR-21 水平显著高于 L-O2 细胞。RT-qPCR 结果与使用 PERFECT技术分析的结果一致，进一步验证了本方法的应用可靠性。
图4.PERFECT技术检测细胞来源的外泌体源性miRNA
五、临床样品实验
最后，我们对PERFECT技术其在临床样本中的检测性能进行了评估。通过从14份临床样本（7名健康志愿者和7名肝癌患者）中提取外泌体并分离总RNA，利用RT-qPCR（图5A）和PERFECT方法（图5B）分析miR-21水平。结果显示，PERFECT方法能有效区分患者和健康对照（p<0.001），受试者工作特性曲线（ROC）曲线分析显示曲线下面积（AUC）值为0.936（图5C），表明其高灵敏度和特异性，HCC患者血浆外泌体中miR-21显著上调，这跟先前的研究相符合（图5D）。该研究展示了PERFECT技术在检测外泌体源性miRNA及其在癌症早期诊断中的应用潜力，为肝癌的非侵入性肿瘤标志物检测和诊断提供了有力支持。
图5. PERFECT技术检测临床样本中的外泌体源性miR-21
小结：
综上所述，这项研究提出了一种基于引物交换反应级联RNA转录的检测技术（PERFECT），用于外泌体源性miR-21的精准监测及肝癌诊断。通过标准样品、细胞样品及临床样本的检测，结果表明PERFECT技术在外泌体源性miRNA检测中表现出色，能够实现对肝癌患者的精准诊断。此外，该研究为外泌体在癌症诊断中的应用提供了创新性贡献，推动了外泌体源性miRNA在肿瘤标志物检测领域的发展。
参考文献：
Primer Exchange Reaction with Cascade RNA Transcription for Highly Specific Detection of Exosomal miRNA and Liver Cancer Diagnosis. Analytical Chemistry, 2025. DOI: 10.1021/acs.analchem.4c06517
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