在生物医学研究领域，细胞外囊泡（EVs）作为一类极具潜力的生物标志物，近年来受到了广泛关注。EVs 是由细胞分泌的磷脂双层包裹的颗粒，广泛存在于各种体液中，携带蛋白质、核酸等生物分子，在细胞间通讯中发挥关键作用，为疾病诊断和治疗提供了新的方向。然而，EVs 的分离和分析面临诸多挑战，传统方法存在效率低、纯度差等问题。微流控技术的出现为解决这些难题带来了新的契机，在 EVs 研究领域展现出巨大的应用潜力。
近日，海南大学徐顺清教授/陈小锋副研究员团队在Analytical Chemistry杂志上发表题为“Microfluidic Innovations for Enhanced Extracellular Vesicle Isolation and Analysis: A Comprehensive Review”的综述文章，全面探讨了微流控辅助 EVs 分离技术的最新进展，详细分析了其优缺点，并对 EVs 内含物的分析方法进行了综合概述。同时，文章强调了这些技术在疾病诊断方面的巨大潜力，凸显了其转化应用的前景。第一作者朱琳，通讯作者陈小锋、徐顺清。
微流控芯片具有试剂用量少、高通量、精准操控流体和高度集成化的优势，在 EVs 分离方面主要有基于亲和作用和无标记策略两类方法。
基于亲和作用的微流控芯片，利用特异性识别元件与 EVs 表面生物标志物结合来捕获目标 EVs。抗体是常用的识别元件，Kang 等人将包含黑色素瘤细胞粘附分子（MCAM）和黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖（MCSP）的抗体固定在微流控平台的微柱表面，实现了循环肿瘤细胞（CTCs）和 EVs 的同时分离（图1A），但该方法存在捕获效率受影响和捕获后 EVs 难以回收的问题。为解决这些问题，Zhang 等人采用多尺度集成设计自组装（MINDS）策略，构建三维多孔蛇形纳米结构微流控芯片，提升了 EVs 的分离和检测能力（图1B）。Kelley 团队开发磁激活纳米细胞术平台，利用与抗程序性细胞死亡配体 1（PD- L1）抗体偶联的磁性纳米颗粒标记 EVs，实现了对不同 PD- L1 表达水平的 EVs 的选择性收获和游离 EVs 的回收（图1C）。
图1. 基于抗体的微流控芯片
与抗体相比，适配体成本低、合成简单、稳定性高，且尺寸小能实现更高密度结合。Lu 等人通过级联两个鱼骨结构（HB）单元的微流控芯片设计，利用针对上皮细胞粘附分子（EpCAM）和 PD-L1 的双适配体，实现了对 EV 亚群的选择性分离，为肿瘤免疫异质性研究提供了新视角（图2）。此外，特定肽和纳米抗体等也用于基于亲和作用的 EVs 分离。此外，特定肽合成简便、免疫原性低，纳米抗体尺寸小、稳定性好、易于功能化，丰富了 EVs 分离手段。
图2. 基于适配体的微流控芯片
无标记的微流控分离方法利用 EVs 与其他生物颗粒的物理特性差异实现分离，具有成本低、操作简单的优点。基于流体动力学原理的方法，通过设计微流控通道内的流体流动来分离 EVs。Hattori 等人报道的基于确定性侧向位移（DLD）原理的微流控芯片，采用电渗流（EOF）操控纳米流体系统分离 EVs（图3A）。纳米 DLD 芯片制造复杂，捕获效率有待提高。Sun 团队引入的 λ - DNA 介导的粘弹性微流控平台，则实现了高效的尺寸选择性 EVs 分离（图3B）。一种带有重复波浪形通道的设计，可诱导 Dean 二次流，并结合生物相容性聚合物溶液，实现弹性惯性聚焦和 EVs 分离（图3C）。
图3. 无标记的微流控芯片分离
该综述梳理评估了 EVs 内含物（特别是蛋白质和核酸）的方法的最新进展，以概述利用 EVs 获取诊断和治疗信息的发展现状。EVs 内含物的研究成为液体活检应用中的重要手段，这些应用涵盖早期癌症筛查、肿瘤分类、转移潜能评估以及癌症治疗监测等领域。传统蛋白质分析方法存在诸多局限，质谱技术结合微流控装置提高了蛋白质分析的效率和灵敏度。核酸在 EVs 货物中参与基因表达调控，科研人员通过分析 EVs 中的核酸，发现了许多与疾病相关的生物标志物，核酸检测基于扩增、杂交和下一代测序等原理，不同方法相互补充。
总结：该综述涵盖了一系列基于微流控芯片的平台，用于 EVs 的分离以及后续对其多样内含物的分析。基于亲和的 EVs 分离微流控技术，借助抗体、适配体、肽或纳米抗体与疾病生物标志物（主要是蛋白质）之间的特异性相互作用，实现了较高的捕获效率和 EVs 纯度。然而，这些方法面临着成本高昂、芯片制造和操作复杂，以及难以高效释放捕获的EVs 用于下游分析等问题，限制了其在临床中的广泛应用。另一方面，无标记分离技术利用微流控芯片，依据 EVs 与周围生物颗粒在大小、密度、可变形性和电学性质等方面的差异进行分离。这些技术具有成本低、操作简便和可扩展性强等优点，但在产量、纯度以及可能对 EVs 造成机械损伤等方面存在局限。对 EVs 内含物（包括蛋白质和核酸）的分析，在基于 EVs 的疾病诊断中至关重要。本文总结了疾病诊断中常用的蛋白质和核酸，以及内含物分析的常用策略。整合组学方法对 EVs 内含物（尤其是蛋白质和核酸领域）进行全面分析，代表了未来研究的前沿方向。这些努力有望显著提高诊断精度，为 EVs 在临床实践中的广泛应用奠定基础。
参考文献：
Microfluidic Innovations for Enhanced Extracellular Vesicle Isolation and Analysis: A Comprehensive Review. Analytical Chemistry, 2025, 97(9): 4695-705.
外泌体资讯网 Anal. Chem.｜海南大学徐顺清教授/陈小锋副研究员团队：微流控技术在细胞外囊泡分离与分析中的创新进展
