循环生物标志物：多部分组成的复杂领域
循环生物标志物种类纷繁，主要包括糖、胆固醇和蛋白质生物标志物，例如C-反应蛋白（CRP）、循环的游离DNA（cfDNA）和循环RNA。此外，循环生物标志物还包括某些基因，如BCRA1、KRAS和其它基因。目前，该领域甚至囊括了循环肿瘤细胞（CTCs）和外泌体/胞外囊泡（EVs）。
本文的主要内容
本文为我们系统地分析了循环生物标志物领域各方面的最新发展趋势。循环生物标志物研究报告集中于一批分析类/组。最近几年，以下的一些类别逐渐引起了人们的兴趣和关注，特别是：
• 循环的游离核酸（循环的游离DNA和RNA）
• 循环肿瘤细胞（CTCs）
• 胞外囊泡（外泌体，微囊泡）
我们将为大家呈现不同类别循环生物标志物最新文献的汇总和分析，以此来说明该技术的使用、针对疾病的处理和每一个组成部分的发展轨迹。
图1循环生物标志物不同类别的文献发表量
不同类别循环标志物的文献发表量
我们在PubMed网站上采用了多种关键词的不同组合进行了全面的检索，并建立了如图1所示的发表文献数据库。检索记录的多少反映了该研究方向的文献发表量；这个数据库包括的文献发表在2000-2016年。每一个类别循环标志物在PubMed上的文献发表量的增长率如图2所示。
循环生物标志物研究领域的弱联系
我们将生物标志物研究分为四个主要大类：传统循环生物标志物，循环DNA/RNA、循环肿瘤细胞（CTCs）和胞外囊泡/外泌体。通过计算循环生物标志物四个类别中共有的发表文献，我们可以测定不同类别中的交叉水平。表1的结果显示，循环生物标志物领域不同类别的发展更倾向于独立，而非共同发展，这意味着交叉协作或许可以更好地促使该领域发展。
数据库的分割
为了更好地了解上述四类生物标志物研究的关系，我们依据关键词将发表文献数据库分为不同的部分。我们仔细阅读了检索获得的25,604篇文献所描述的病人特征、检测方法、材料、基因和其它材料。我们在下面将向大家展示一些更为有趣的发现。
肿瘤是循环生物标志物领域的发展驱动力
在循环生物标志物四个类别的研究中，肿瘤几乎占据了每一个类别的最大份额。图3、4和5分别说明了肿瘤研究在循环标志物领域的增长量，女性常见癌-乳腺癌研究的增长量，以及癌症发展的关键步骤-转移研究的增长量。
结果已经显而易见，不同类别循环生物标志物的文献发表均由肿瘤研究所驱动。当然，亦如预期一致，肿瘤研究大大促进了循环肿瘤细胞（CTCs）的发展。在图3中，我们依据不同的循环生物标志物类别对乳腺癌的发表刊物进行了划分。
同样的，我们看到了所有类别的循环标志物研究均由乳腺癌所驱动，特别是循环肿瘤细胞CTCs）。当然，这不足为奇，因为很大一部分的循环肿瘤细胞（CTCs）的研究均采用了乳腺癌的肿瘤模型，加之循环肿瘤细胞（CTCs）研究领域中乳腺癌相关文献发表刊物量的变化与该趋势是完全吻合的。
图5的结果说明循环肿瘤细胞（CTCs）是肿瘤转移领域的主要研究方向，与之吻合的是CTCs被认为是驱动肿瘤转移的一个中介物。
外泌体和胞外囊泡
从研究视角来看，循环生物标志物的这部分目前是让人们极为感兴趣的方向，以及胞外囊泡或外泌体具有生物标志物运载体的潜能。我们希望了解该部分相较于其它循环生物标志物的发表刊物相对出增长量。图6展示了外泌体的文献发表量。
正如我们所预期的，该数据显示了与囊泡部分极为明显的相关性，并提供了应用于该分析的方法、检索和算法的良好内部控制。我们可以在图7的胞外囊泡和图8的微囊泡看到类似的结果。
图（6）相较于其它循环标志物类别的外泌体相对发表量。（7）相较于其它循环标志物类别的胞外囊泡（EVs）相对发表量。（8）相较于其它循环标志物类别的微囊泡相对发表量。
新技术对于循环生物标志物类别的影响
我们希望更进一步了解不同的技术平台，例如定量PCR（qPCR）、RNA测序（RNA-Seq）和二代测序（NGS），以及蛋白质组学平台，对于循环生物标志物发展的影响，这些技术平台目前已被用来研究和揭示不同类别循环生物标志物的标志物载体。
如图9所示，循环游离核酸受到的影响最大，这亦让我们深刻地了解到qPCR在这领域作为一个重要的技术平台。
图10说明了RNA-Seq对于不同类别循环标志物的影响。我们的数据显示，除了循环肿瘤（CTCs）外，其它三类循环生物标志物大大地渗透到了RNA-Seq领域。确实如此，大量的研究关注循环的游离核酸和表征囊泡里的RNA载体。应该注意的是外泌体和胞外囊泡研究中的标志物大多数是RNA载体。
此外，我们想问的是循环生物标志物的那一部分涉及了蛋白质组分（蛋白质组学）的研究。图11则向我们展现了这些数据。
正如数据所示，囊泡包括了参与蛋白质组学分析的循环生物标志物。这非常重要，因为它说明了胞外囊泡研究领域远非核酸载体，亦开始聚焦开发这些循环标志物内的蛋白质组分。我们将继续监测该领域来评估研究发展趋势。
最后，图12呈现了NGS对于不同生物标志物的影响。这些数据清晰地说明了循环核酸受到的影响是最大的。这是由于循环的游离核酸（如cfDNA）的复杂性造成的，因为它来源于基因组DNA。大多数的cfDNA来自于正常基因组序列，突变（肿瘤突变，驱动突变等）需要从基因组的“汪洋大海”中捕获。NGS则可以做到这样，测序覆盖深度将决定发现疾病相关稀有突变的窗口。
图12 NGS用于研究循环生物标志物
总结和结论
我们将循环生物标志物研究概括为四大类，分别是传统可溶性标志物、循环DNA/RNA、循环肿瘤细胞和循环囊泡（如外泌体、胞外囊泡和微囊泡）。循环生物标志物构成了略有重叠的四个研究领域。相互协作似乎在这些领域并不常见，因此有可能存在很大的机会去提高诊断测试开发商和用户对于该领域的接受度。
和很多生物学领域一样，肿瘤是主要的驱动因素。我们的结果说明了大量的其它领域，例如自身免疫性疾病、神经性疾病和感染性疾病，亦是重要的驱动因素（数据未展示）。
如预期一致，qPCR是一个重要的工具。在该领域大量使用的还有荧光法、抗体法和分光光度法（数据未展示）。正如我们所预期的，NGS是该领域冉冉升起的新星。有趣的是，蛋白质组学很大一部分限于外泌体领域，这提示我们研究团队的兴趣点在于开发外泌体/胞外囊泡的所有标志物载体。
我们相信这份比较循环生物标志物不同部分的行业分析是第一份全球性的分析报告，该分析报告将各个不同的新兴领域汇总在一起进行比较和对比。再者，从平行和整体角度来观察这些领域的能力使得我们可视化它们的发展轨迹，以及不同技术平台（如NGS）在一个或多个标志物类别的应用。我们的数据库相当全面和具体，因为我们的分析精细到单分子实体水平（基因、蛋白、microRNA等）。这个数据库的价值在于它让我们能够查看这些分子对于不同循环生物标志物类别的影响（数据未展示）。
最后，我们相信该分析是研究生命科学新兴领域的一种正确方式；也就是说，将一个领域分解为多个组成部分，并分析每一个部分以及与其它部分进行比较分析，从而评价单独和相互比较的定性和定量指标。
