今天我们谈谈目前研究领域的一大新秀---细胞外囊泡（EVs），一种广泛存在于循环体内的细胞分泌的膜性纳米级微粒。说起囊泡，本君不得不再道一下囊泡的坎坷生世，别看现在囊泡集万千宠爱与一身，但是在囊泡发现初始，并没有受到重视，研究者将其视为细胞代谢的垃圾；随着对囊泡的认识不断深入，发现其具有重要的物质运载和信息传递作用，不仅参与心血管、肿瘤、神经系统等各大疾病的发生发展，而且可作为疾病的潜在生物标记物，用于疾病的早期非侵入性诊断以及预后观察等。
分离细胞外囊泡是研究囊泡的第一步也是至关重要的一步，只有得到纯度高的EVs，去除蛋白质、核酸、非靶-EVs等干扰物，才能进行下游的物质结构和功能的分析，但是国际上还没有制定标准的分离方法，各商家借此契机，“各显神通”，已有公司研发出专门的商品化试剂盒：加入特定EVs沉淀剂，使用普通离心机即可分离出EVs，简便快速；此外，也有研究者使用免疫亲和法，该法建立在单克隆抗体基础上，并加入抗体（anti-PSMA）标记的生物素和链霉素包被的磁珠，能高效特异地分离出表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）的EVs（如图一）。
图 一： 蓝色微粒不表达PSMA；绿色微粒表达PSMA；结合有生物素标记anti-PSMA的微粒；结合有链霉素包被磁珠的微粒
为比较各方法的特异性和纯化度，Sabine I. Brett等使用不同方法制备EVs：3种试剂盒（ExoQuick Kit、ExoSpin Kit、Total Exosome Kit），免疫亲和法，然后通过原子力显微镜（AFM）和纳米级流式细胞仪（NFC）从不同方面验证并分析分离纯化的EVs。
NFC对分离纯化后的囊泡进行多参数、高通量的定量分析。首先利用硅胶纳米颗粒描绘出粒子大小校准图（如图二）；然后加入荧光素，对图像进行设门选出特定区域，分别以长角度散射光和荧光为横、纵坐标表示粒子的分布情况，红色区域（PE）代表为靶-EVs(100-250nm)，下方的蓝色区域（FITC）为其他EVs（如图三）；最后通过靶-Evs占总-Evs的比例比较各方法的纯化度（如图四）：A表示免疫亲和法制备出的Evs，B-D表示三种试剂盒制备出的Evs，很明显，A中红色区域比例较大，大小分布在100-250nm之间，并且红色区域外的EVs较少，表明免疫亲和法分离特异性高，纯度高，能有效去除干扰物。
图 二：NFC测得不同大小的硅胶纳米颗粒长（LALS）-短（SALS）散射光校准示意图
图 三：NFC测定前列腺细胞分泌的EVs示意图，以LALS为横坐标表示EVs大小（从左到右依次增加），已荧光素为纵坐标表示EVs上PSMA的表达量（从下到上依次增加），红色（PE）框内代表靶-EVs，蓝色（FITC）框内代表非靶-Evs。
图 四： 不同方法制备的EVs的AFM（左）和NFC（右）图。A为免疫亲和法，B-D为试剂盒
AFM以纳米级分辨率获得固体材料表面形貌结构信息及表面粗糙度信息，是目前唯一能从形态上区分EVs和干扰物（如蛋白质），通过定量分析粒子的高度与宽度得出其大小和形态（如图五）。AFM结果显示，由免疫亲和法制备的EVs高度大于100nm，其中的蛋白质高度小于10nm（如图四A），两者具有明显差别；而试剂盒制备结果不理想，大部分粒子高度低于100nm并混有大量蛋白质（如图四B-D）。
图 五： 免疫亲和法制备纯化的前列腺细胞分泌的EVs的AFM示意图。A表示EVs的一维高度与宽度；B表示单个EV的二维图像；C表示单个EV的三维图像；D表示单个EV的扫描图谱，各图表明EVs的直径为100nm左右。
虽然使用试剂盒制备EVs简便快速，但是其分离纯度低，不能去除EVs中的一些可溶性蛋白质、核酸、非靶EVs等干扰物，影响下游的分析工作，特别蛋白质组学分析；相比之下，免疫亲和法利用抗原抗体的特异性和磁珠高效分离性质，达到极高的分离纯度，有效除去蛋白质等干扰物；但是该方法具有一定的局限性，其一制备出亲和力高的单克隆抗体成本较大，其二该实验的设备（AFM、NFC）并不是所有实验室都具备，很难广泛应用于基础研究。最后，不得不说一句：每个以成形的方法都有其优缺点，至于使用何种方法来完成实验，要从多方面考虑，选出既高效又经济的方法。
参考文献：Brett SI, Lucien F; Immunoaffinity based methods are superior to kits for purification of prostate derived extracellular vesicles from plasma samples. The Prostate; 2017 Aug 1. doi: 10.1002/pros.23393.
版权所有，未经许可禁止转载。转载请联系本网站和原作者获取授权。
外泌体资讯网 谁与争锋——囊泡分离法比较：试剂盒 AND 免疫亲和法
