今天给各位新进外泌体领域的朋友第二期基础知识介绍。
经常被一些朋友询问外泌体或微囊泡等细胞外囊泡的起源于发生，以及为什么选择CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX等作为外泌体或者细胞外囊泡的标志物。更有一些新入门的朋友疑惑这些标志物蛋白到底是仅存在于囊泡里还是细胞里也有。针对这些问题，hzangs今天参考已有的综述简要介绍一下细胞外囊泡的不同起源及涉及到的内容物分选系统。
先放一张图给大家看：
外泌体和微囊泡的起源区分和可能的共同点
外泌体和微囊泡具有不同的生物发生过程，同时它们的发生过程又都涉及膜运输过程。外泌体起源于质膜循环途径中的膜腔或早期胞内体，这些膜腔或早期胞内体会向内凹陷形成管腔内膜泡（ILV），进一步发展成为多泡小体（MVB），多泡小体在细胞内分子马达的牵引下与细胞表面融合，最终分泌出去。而微囊泡直接起源于质膜，在质膜上直接向外出芽并与胞体脱离形成囊泡。 其实这种命名仍然是有一些问题的，因为细胞外囊泡生物合成途径可能根据生产细胞类型而不同。例如，T细胞主要从细胞表面产生具有外泌体特征的细胞外囊泡，而这一过程可能是与管腔内囊泡和多泡小体的形成共用了一些分子机器和组装机制。这里只是给大家一个特殊的例子，大家知道就好，目前主要的分类方法还是按照起源位置不同来区分。
外泌体和微囊泡内容物的合成和装载
外泌体和微囊泡都具有十分丰富的内容物，这些内容物包括很多种类的蛋白质和RNA。这些内容物通常是在各自通常存在的位置被合成出来，再由分子机器运送到特定的地点，之后通过内容物的聚集和出芽，最终通过特定的分子机器切割形成闭合膜结构。
外泌体生物合成相关的分子机器
在成熟为MVE的过程中，外泌体在胞内体的内腔中作为ILV产生，该过程涉及特定的分选机器。这些机械装置首先将货物分离到MVE的特定区域内，一般称之为微域，随后向内萌发和分裂含有隔离胞质溶胶的小膜囊泡。ESCRT复合体是膜形成和断裂的驱动器。 ESCRT复合体以一定的顺序发挥功能，首先ESCRT0和ESCRTI将泛素化的跨膜货物亚基限制在MVE的限制性膜的微域中同时造成膜结构的变形，并通过ESCRTII募集执行该微域萌芽和切割的ESCRT-III复合体。ESCRT机制在ILV生物发生中的作用和一些ESCRT亚单位在外泌体中的存在是的我们可以通过操纵ESCRT组分来了解和调节外泌体的形成。学者们通过siRNA技术靶向ESCRT复合体和相关蛋白的多个组分的揭示了该家族的成员在外泌体生成中的各种角色。它们的失活影响分泌的效率或分泌的组成，这些研究表明一些ESCRT组分可以选择性作用于MVB和ILV亚群，将这些MVB作为外泌体进行释放。经典的ESCRT通路可以与syntenin和ESCRT辅助蛋白ALG2相互作用蛋白X（ALIX;也称为程序性细胞死亡6β相互作用蛋白）相互作用，并桥接ESCRT-III亚基液泡蛋白分选相关蛋白32（VPS32;也被称为CHMP4），最终执行囊泡的切割功能，形成一个封闭的囊泡。另一方面，有学者将ESCRT复合体敲除，但是依旧发现会有含有CD63标志物的外泌体释放发生。这说明外泌体也可以以ESCRT非依赖的方式形成。第一个ESCRT非依赖性的机制是中性II型鞘磷脂酶产生神经酰胺。然后神经酰胺可以允许产生膜的子域，在这些膜上依靠自己的结构改变膜的曲度。另外tetraspanin（四次跨膜蛋白）家族的蛋白已经显示出调节参与ESCRT依赖性和ESCRT非依赖性的囊泡内容物分选。这些蛋白之一是CD63，还有四跨膜蛋白CD81和CD9也直接参与各种货物向外泌体的分选。 最近的研究发现CD81的结构类似于锥形，其中可以容纳胆固醇分子，这些四次跨膜蛋白聚集也可能促进了膜曲度的变化。
现在来回答经常被问及的问题：
1. 为什么会选择CD63、CD9、CD81 以及TSG101、HSP70、ALIX等作为外泌体或者细胞外囊泡的标志物。
其实看过上面的内容相信大家也就差不多明白了。 这些蛋白标志物其实最初是通过纯化细胞外囊泡然后通过质朴分析发现的存在于细胞外囊泡的一些高丰度蛋白，因此也就开始逐渐将他们作为细胞外囊泡标志物。其实这里是有一定的道理的，CD63、CD9、CD81三个蛋白都是四次跨膜淡白家族的成员，他们直接参与了细胞外囊泡内容物的分选，TSG101是ESCRT复合体相关的蛋白，ALIX直接涉及到了膜泡在形成过程中切割脱离质膜形成独立膜结构的过程。
2. 细胞外囊泡标志性蛋白是细胞外囊泡上独有的么？
这个问题的答案当然是否定的。这些标志物蛋白其实主要是涉及到了囊泡的形成和分泌过程，多数是膜蛋白或者是ESCRT复合体成员及其相关蛋白，他们产生于细胞中，定位于胞内的膜结构附近，因此细胞中自然也会存在。只是因为细胞外囊泡的形成依赖于这些分子，因此这些分子在囊泡中发挥功能，因此在囊泡中丰度要明显比细胞中更高一些。因此各位新朋友们，再杂蛋白的时候看到细胞裂解液样品中杂到CD63等外泌体标志物，不要再来问我了哦。
PS：这里提示一下。细胞外囊泡虽然是脱离细胞存在的结构，但它们毕竟都是细胞起源的，目前确实没有看到报道说细胞外囊泡具有特异性的细胞没有的蛋白，另一方面由于细胞外囊泡的亚群无论是大小还是密度还是表面标志性蛋白都多多少少有所重叠，所以目前没有太好的办法来拿到非常纯的囊泡亚群。因此按照一些综述的讨论，目前更建议大家讲自己分离得到的囊泡称作为small extracellular vesicle （sEV），也就是小细胞外囊泡。
今天就先介绍这些吧。
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