本周的周总结会在周日准时发送给大家。近期journal of extracellular vesicle发布了新版本的《指导要求》，也就是《MISEV 2018》。这一版的内容要相对2014年的更多更复杂。Hzangs会隔三差五的解读一些重要内容。希望对大家有所帮助。
以下内容均来自《MISEV 2018》，hzangs的评论会特别注明。
命名法问题
ISEV认可“细胞外囊泡”（EV）作为从细胞中自然释放的颗粒的通用术语，其由脂质双层包裹并且不能复制，即不含有功能性核。目前针对细胞外囊泡不同亚群的标志物还没有形成共识（例如，胞内体起源的外泌体和质膜衍生的微囊泡目前依旧没有大家认可的标志物进行区分）。在能够通过实时成像技术来追踪细胞外囊泡起源位置之前，将细胞外囊泡归入特定的发生途径还很困难。因此，除非研究者可以通过自己的实验证明其囊泡来源，否则我们要求研究者考虑使用细胞外囊泡亚类型的术语来称呼这些囊泡，这些术语包括a、依据大小区分的（这些术语涉及a）EV的物理特征，例如大小（“小” EV（“sEVs”）和“中/大EV”（m / lEVs），其范围分别定义为，例如，<100nm或<200nm [小]，或> 200nm [大和/或中等]）或密度（低，中，高，每个范围都有定义）; b）生化成分（CD63 + / CD81 + - EV，膜联蛋白A5染色的EV等）;或c）来源（例如足细胞EV，缺氧EV，大型oncosomes，凋亡小体）的描述。）外泌体和微囊泡，这些术语在历史上存在多种相互矛盾的定义。如果认为不可避免地使用这些或新创造的术语，则应在每个出版物开始时明确和突出地定义它们。如果根据本MISEV2018出版物的最低要求无法确认EV同一性，则其他术语如细胞外颗粒（EP）可能更合适。（Hzangs注： 关于命名法这一方面，仁者见仁智者见智。既然有这样的要求，大家就注意点吧。）
收集和预处理过程中需要注意的可控变量
细胞上清液
所有细胞研究都建议采取一些预防措施，例如定期确认细胞特性（例如通过短串联重复序列（STR）分析或其他方法），鉴定细胞谱系和来源，包括永生化模式。对于EV研究尤其重要的是应该记录并报道EV收获时死细胞的百分比，因为即使一小部分细胞死亡释放的凋亡膜泡也可以超过存活细胞释放的EV。 量化凋亡和坏死细胞的百分比是有用的。特定条件下，也应该报告细胞的其他相关特征，包括活化状态，恶性程度和衰老。在文章的方法部分需要提供所有培养基组成和制备细节。这应该是细胞培养研究的惯例，并且在细胞外囊泡研究中是非常重要的，因为诸如葡萄糖，抗生素和生长因子的补充剂可以影响EV产生以及内容物组成。当培养液的补充物种有含EV成分（如血清、胆汁盐、垂体提取物等）时，实验应该包括一个培养基对照来评估培养基本身的贡献（即：配制好的，未培养细胞的培液作为对照，hzangs注）。也可以通过预先使用没有去除EV的培液进行培养，在收集细胞释放的EV时再更换为无EV的培液。如果细胞在含有EV的培液中和无EV的培液中的状态存在很大差别，则需要在文章中报告这一现象。商业“外泌体/ EV耗尽”血清和其他补充剂越来越容易从供应商处获得。但是由于供应商通常没有指出耗尽方法，因此可能无法预测对细胞生长和EV释放的影响;应给出耗尽补充剂中EV的确切来源，方法和参考文献。商业化的“外泌体/ EV耗尽”血清和其他补充剂在使用前应仔细检查产品的“无外泌体/EV”性质。最后，应报告介质制备细节，包括加热（热灭活）或过滤步骤。
生物体液
由于哺乳动物中存在超过30种类型的生物体液，并且许多区室的灌洗使这一数字更加庞大（尽管不是真正的生物体液），MISEV2018没有提供关于与所有生物体液相关的分析前变量的文献详尽综述。每种生物流体都具有特定的生物物理和化学特性，使其与条件培养基不同，在分离纯化细胞外囊泡时必须考虑到这一点。例如，血浆和血清比条件培养基更粘稠。血浆和血清含有大量非EV脂质结构（低/极低/高密度脂蛋白），牛奶充满含脂肪的液泡，尿液含有尿调节素（Tamm-Horsfall蛋白），支气管肺泡灌洗液含表面活性剂，所有这些成分都会与EV不同程度的共分离出来。在每种情况下，可能都需要考虑将EV与这些组分分开的具体措施。对于生物体液（如血浆）的EV分离/表征，以前的几份ISEV立场文件和其他出版物（仅举几个例子）列出了对标准化很重要的报告要求，即使有很多问题，这些要求今天仍然有效。关于特定预分析变量对不同类别细胞外囊泡的影响。由于这些先前的出版物中已涵盖了许多这些因素，因此我们不在此详尽地对其进行全面汇总（具体MISEV2018 参考文献55~63， hzangs注）。举例说明血液衍生物的考虑因素，如血浆：供体年龄，生物性别，当前或以前的怀孕情况，更年期，餐前或餐后状态（禁食/非禁食），采集时间（昼夜变化），运动水平和时间，进行的最后一项运动，饮食，体重指数，特定传染病和非传染病，药物和其他因素。同样，技术因素包括液体收集量，首管是否丢弃，容器类型，加工时间，抗凝剂（血浆）选择，混合或搅拌情况，温度（储存和加工），运输描述（如果有的话） ，处理前管子是否保持直立，精确离心或过滤程序，溶血程度，储存前确认血小板和脂蛋白耗尽，以及其他参数应清楚标明。总体而言，除了一些特异性的血浆/血清（例如血小板去除和凝血）之外，上面列出的收集条件的技术细节适用于所有生物流体，并且研究者在发表文章时必须进行报告。
组织
作为预分析问题的一个特例，越来越多的研究人员开始进行组织EV的分离纯化。这些研究可能涉及组织外植体的短期培养，例如离体肿瘤或胎盘，或从整个组织中提取。适用于细胞和生物流体研究的许多相同考虑因素也适用于此，包括确认起源和条件。特别是对于从组织中提取EV，确保回收的囊泡真正来自细胞外空间是有挑战性的，如何排除细胞内囊泡或从组织收获，加工（例如机械破坏）或储存（包括冷冻）中破碎的细胞释放的人工颗粒是目前的主要问题）。细胞外囊泡分离方法与神经突出囊泡分离方法存在一定的相似性，因此在像大脑这样的组织中分离细胞外囊泡可能尤其具有挑战性。即使是组织衍生的EV也可以含有内体组分，其可以对应于细胞内囊泡的组分，包括在组织加工过程中人工释放的晚期内体/多泡体（MVB）以及管腔内囊泡。最近对这些挑战的认识促使研究人员进行温和的组织破坏（即将EV与细胞和细胞外基质分离，但不破坏细胞）和进一步分离的几个步骤（包括密度梯度），然后严格表征多个阴性标记物，从而更有说服力证明其样品是组织来源的EV制剂。使用转基因模型追踪特定细胞的EV释放也是一种有用的方法。
细胞外囊泡样品的储存
基质（例如生物流体，组织，条件培养基）和分离的EV的存储和回收条件可以影响EV特性，包括稳定性，颗粒数量，聚集和功能（详情参考MISEV2018 参考文献57,62,63,71,86–96。 Hzangs注）。高度纯化的EV可能在储存时通过粘附到储存容器的表面而损失。如何制备和储存生物流体，组织或介质（储存容器的类型，温度等）以及持续多长时间？ 将分离的EV用于后续实验之前是否对EV样品进行冷冻/解冻，冻干和重构等？ 如果冷冻，如何进行冷冻和解冻？ EV存储在哪些缓冲液中？ 多长时间？ 使用什么冷冻保护剂？ 每个样本经历了多少次冻融循环？ 如果以某种其他方式处理和存储EV，则还应提供详细信息，以及评估存储方法和时间对EV活动和其他属性的影响的程序。 （一句话，请详细记录细胞外囊泡经过的处理步骤。 Hzangs注）
今天就先整理到这里。估计看完这些，很多朋友都已经要崩溃了。按照这些要求来做，基本上大家就没办法发文章，没办法毕业了。Hzangs在这里还是要安慰大家几句，Thery大妈是个强迫症，但是她没办法要求所有人陪着她强迫症。举个极端的例子，我们总不能拿着比发Nature还高的要求来约束发表在plos one的研究。大家根据自己的课题水平以及未来计划投稿的杂志水平来进行自己的实验就好。上面这些内容学习一下，有备无患。未来会不定期解读MISEV2018。大家感兴趣的可以持续关注一下。
O(*￣—￣*)o 让我们沐浴春风，收获paper~ 大家加油~
外泌体资讯网 【新手福利】MISEV2018解读（一）
