本周hzangs在最新文献中选取了6 篇分享给大家，其中 5篇提供中文摘要，另外还有新英格兰杂志上的几篇短letter。发表在新英格兰医学杂志上的letter主要关注了之前发表的那一篇循环系统细胞外囊泡与人类疾病的综述，对这一综述进行了补充和讨论，补充内容主要在于细胞外囊泡相关DNA以及细胞外囊泡携带内容物的特异性及形成调控，hzangs对这些letters进行了全文翻译，感兴趣的可以看看；第1篇文章介绍了通过在CD9分子上融合RNA结合蛋白提升细胞外囊泡的RNA等分子的装载效率；第2篇介绍了一个参与细胞外囊泡合成和释放调控的lncRNA，这是细胞外囊泡合成和释放调控过程中报道的第一个研究较为透彻的lncRNA；第3篇文章介绍了突变型p53基因在肿瘤细胞及基质细胞间传递影响肿瘤进展的报道。相关文章的原文在周一前会发布到论坛同名贴下，需要的可以到论坛下载
Letter：Circulating Extracellular Vesicles in Human Disease.循环系统中的细胞外囊泡与人类疾病。 [N Engl J Med] IF=79.258 PMID：30485772、30499642、30499643
内容：九月份的时候新英格兰医学杂志曾经发表过一篇关于循环系统中细胞外囊泡与人类疾病的综述文章。针对这一综述文章，有学者发表了letter进行了补充和讨论。内容比较干练，认识也很深刻。
Letter 1：Shah等人。 （9月6日）对细胞外囊泡在人类疾病中的作用及其临床意义进行了全面综述。在该文章中，对细胞外囊泡中包含的核酸的讨论仅集中于RNA（例如，信使RNA [mRNA]和小的非编码RNA）。然而，细胞外囊泡中的DNA也很重要，并且大部分循环无细胞DNA位于外泌体中.一项胰腺癌研究表明，外周循环外泌体DNA的水平可能是比循环肿瘤DNA更好的结果预测因子。循环外泌体中的双链DNA片段已被证明是嗜铬细胞瘤或副神经节瘤患者肿瘤基因组的优良代表，这表明它们在诊断和术前评估中具有潜在的应用价值。自闭症谱系障碍患儿循环细胞外囊泡中含有的线粒体DNA高于对照组.DNA在细胞外囊泡中的重要性是我们值得关注和强调的。
Letter 2：低水平的microRNA（miRNA）可能使Shah等人提出的脑脊液（CSF）分析复杂化，其他流体和外泌体富集可能有助于提高miRNA检测的灵敏度。然而，外泌体不是被动或“溢出”过程的结果。虽然外泌体的分选和形成机制仍然不完全清楚，但我们知道它们的生物发生和释放是受到严格调节的过程。因此，整体体液中和富含外泌体的部分中的miRNA特征可能不同，正如阿尔茨海默病患者的脑脊液中所示。换句话说，miRNA的水平取决于miRNA的生物发生以及外泌体的生物发生，并且这两个过程都可能参与疾病的发病机理并受其影响。因此，患者组和对照组中miRNA特征的比较可以在整体体液水平和外泌体富集的级分中产生不同的结果。实际上，这种差异可以作为阿尔茨海默病异常外泌体运输性质的线索，这可能反过来为新疗法提供机会。
作者回复：Tsai等人提出了关于细胞外囊泡已知内容物的一个重要观点。即这些囊泡可能含有DNA。正如Tsai等人所指出的，循环肿瘤细胞DNA的存在可以预测患有特定癌症的患者的预后结果。除Tsai等人引述的疾病，DNA的存在也可能与细胞外囊泡的大小有关，正如最近在前列腺癌患者中的研究所显示的那样，大的细胞外囊泡可能具有反映基因组成分的DNA。同目前关于细胞外囊泡RNA的研究应用一样，需要从人类更大规模的研究中获得更多数据，以阐明这些关于细胞外囊泡DNA的观察结果的临床意义。我们同意Riancho和Sánchez-Juan的评论，尽管外泌体的形成和释放过程尚未完全了解，但它们可能受到高度控制。正如作者所指出的，观察到的miRNA的水平依赖于非编码RNA的生物发生以及外泌体的形成和释放，并且当富集的外泌体相对于整体体液进行研究时，结果将被改变。这一点与Vagner等人的研究以及较大和较小的细胞外囊泡之间的固有差异有关。
PS：这些补充和强调是以letter的形式发表出来的。文章强调了细胞外囊泡相关DNA的一些进展，同时强调了目前细胞外囊泡相关DNA的研究依旧缺乏大规模的验证；另一方面强调了细胞外囊泡的产生存在严格调控，因此细胞外囊泡RNA的组成与体液中总RNA的组成可能存在差异，因此研究细胞外囊泡中的RNA的结果可能和研究整体体液中的RNA结果不一致，这也强调了体液中细胞外囊泡RNA研究的必要性。
- In vitro and in vivo RNA inhibition by CD9-HuR functionalized exosomes encapsulated with miRNA or CRISPR/dCas9. 通过用miRNA或CRISPR / dCas9包封的CD9-HuR功能化外泌体实现在体外和体内的RNA抑制。 [Nano Lett] IF= 08 PMID：30517011
摘要：体外和体内递送感兴趣的RNA有望用于基因治疗。最近，外泌体被认为是RNA递送的理想载体，尤其是miRNA和/或siRNA，而加载效率是目前的一个限制因素。在这项研究中，我们通过构建融合蛋白来设计外泌体用于RNA加载，其中外泌体膜蛋白CD9与RNA结合蛋白融合，而感兴趣的RNA天然地含有或被设计成具有结合元件。通过原理验证实验，我们将CD9与HuR融合，RNA结合蛋白与miR-155相互作用，具有相对高的亲和力。在细胞包装外泌体过程中，当miR-155过度表达时，融合的CD9-HuR成功地将miR-155富集到外泌体中。此外，包封在外泌体中的miR-155可以有效地递送到受体细胞中并识别内源靶标。此外，我们还揭示了当RNA被设计为具有AU富集元件时，CD9-HuR外泌体可以富集功能性miRNA抑制剂或CRISPR / dCas9。总之，我们在此已经建立了一种新的策略，用于将RNA货物包封到工程化外泌体中并在受体细胞中发挥作用。
PS：目前将提高细胞外囊泡对特定成分的装载效率是提高外泌体递送分子效率的手段之一。文章通过将细胞外囊泡表面的标志蛋白CD9融合RNA结合蛋白来实现细胞外囊泡对RNA的装载，这一尝试取得了一定的成功。
- APC-activated long non-coding RNA inhibits colorectal carcinoma pathogenesis through reducing exosome production. APC激活的长非编码RNA通过减少外泌体产生来抑制结肠直肠癌的发病。 [J Clin Invest] IF=13.251 PMID：30511962
摘要：APC基因在结直肠癌（CRC）的发病机制中起关键作用，但针对这一基因的药物开发依旧存在很多挑战。长的非编码RNA（lncRNA）在鉴定癌症病理学和为癌症患者提供治疗选择方面是非常宝贵的。在这里，我们通过lncRNA微阵列筛选鉴定了由APC激活的lncRNA（lncRNA-APC1），并在大量CRC组织中检测了这一lncRNA的表达。 lncRNA-APC1表达的减少与淋巴结和/或远处转移，更晚期的临床分期以及CRC患者的不良预后呈正相关。另外，APC可以通过抑制PPARα在lncRNA-APC1启动子上的富集来增强lncRNA-APC1的表达。lncRNA-APC1可以通过直接结合Rab5b mRNA并降低其稳定性来抑制外泌体的产生，从而抑制CRC细胞生长，转移和肿瘤血管生成。重要的是，源自lncRNA-APC1沉默的CRC细胞的外泌体通过激活内皮细胞中的MAPK途径促进血管发生，此外，外泌体Wnt1通过非经典Wnt信号传导大大增强了CRC细胞增殖和迁移。总的来说，lncRNA-APC1是由APC在CRC的发病机制中调节的关键lncRNA。我们的研究结果表明，APC调节的lncRNA-APC1程序是CRC患者可利用的治疗策略。
PS：目前针对细胞外囊泡合成和释放的调控报道还不是很多，而参与细胞外囊泡合成和释放过程的lncRNA也没有明确研究报道。这篇文章是目前设计lncRNA调控细胞外囊泡合成释放的文章中研究报道比较深入的第一篇，这对我们理解细胞外囊泡的合成和释放的复杂过程具有十分重要的意义。详细内容可阅读往期推文：【JCI】中山大学肿瘤医院谢丹/徐瑞华组：lncRNA-APC1减少外泌体产生抑制结直肠癌进展。
- Mutant p53s generate pro-invasive niches by influencing exosome podocalyxin levels. 突变型p53通过影响外泌体podocalyxin水平产生促侵入“龛”结构。 [Nat Commun] IF= 353 PMID：30498210
摘要：突变型p53s（mutp53）通过上调Rab偶联蛋白（RCP）和二酰基甘油激酶-α（DGKα）依赖性内体再循环来增加癌症侵袭性。在这里，我们研究发现表达mutp53的肿瘤细胞产生外泌体传递mutp53，通过增加其他肿瘤细胞中RCP依赖的整合素循环，介导侵袭/迁移功能在细胞间的转移。这个过程取决于mutp53控制唾液粘蛋白，podocalyxin和Rab35 GTP酶活性的能力，后者与podocalyxin相互作用，影响其对外泌体的分选。来自表达mutp53的肿瘤细胞的外泌体也影响正常成纤维细胞中的整联蛋白运输以促进高度侵入性细胞外基质（ECM）的沉积，并且定量二次谐波生成显微术表明该ECM显示出特征正交形态。具有mutp53驱动的胰腺癌的小鼠的肺ECM也显示出在转移之前增加的正交特征，表明mutp53可以以支持侵入性生长的方式影响远处器官中的微环境。
PS：TP53作为最著名的肿瘤相关基因之一是一个经久不衰的热门分子。其在肿瘤发生发展的多种过程中都发挥着重要的作用。但是目前P53与外泌体相关的报道并不多见，这篇文章则介绍了突变型p53通过外泌体转移到其他细胞来影响肿瘤的进展过程。详细介绍请阅读过往推文：Nature communication：突变型P53影响外泌体足糖萼蛋白水平促进肿瘤侵袭
- Apolipoprotein E4 genotype compromises brain exosome production. IV型载脂蛋白E可能损伤脑中外泌体的产生。 [Brain] IF= 84 PMID：30496349
摘要：载脂蛋白E的ɛ4等位基因是阿尔茨海默病的最大遗传风险因素，同时其的表达可导致衰老期间的认知下降，这一过程独立于阿尔茨海默氏病的β淀粉样蛋白-β和tau病理学。在人死后脑组织和载脂蛋白E人源化的小鼠模型中，我们检查了载脂蛋白E4表达对脑外泌体的影响，所述脑外泌体是在晚期内吞多泡体内产生和分泌的囊泡。与风险中性ɛ3等位基因纯合的人或小鼠相比，我们发现ɛ4等位基因无论是纯合的还是与ɛ3等位基因杂合，都会降低脑细胞外空间中的外泌体水平。在小鼠中，我们发现载脂蛋白E4驱动的脑外泌体水平的变化是年龄依赖性的：虽然在6个月时不存在，但在12个月时可检测到。外泌体途径调节因子肿瘤易感基因101（TSG101）和Ras相关蛋白Rab35（RAB35）的表达水平在蛋白质和mRNA水平上被发现在脑中减少，因此我们认为载脂蛋白E4基因型导致外泌体生物合成和释放的下调。受损的外泌体产生过程可能具有不利影响，包括降低细胞从内体 - 溶酶体系统中消除材料的能力。 12个月大的载脂蛋白E4小鼠的脑外泌体水平降低发生早于我们之前报道的脑内体通路改变，认为载脂蛋白E4驱动的外泌体生成失败在内体和溶酶体缺陷中起主要作用。 E4鼠和人类大脑表达载脂蛋白E4的个体中这些相互依赖的内体 - 外泌体 - 溶酶体系统的破坏可能导致淀粉样蛋白β淀粉样蛋白前体蛋白加工，损害营养信号和突触功能，并干扰神经元降解物质的能力，所有这些事件都可能是导致神经元脆弱性和阿尔茨海默病发展的高风险的诱因。总之，这些数据表明脑中外泌体途径功能障碍是由于载脂蛋白E4表达而发生。
PS：细胞外囊泡在各种生理及病理学过程中的作用报道越来越多，这也证明细胞外囊泡在生物学过程中发挥着重要作用。随着细胞外囊泡研究的不断深入，其产生过程的调控已经开始被越来越多的研究人员关注，近期已经开始断断续续的出现一些细胞外囊泡分选机制、产生机制、释放机制调控相关的研究报道。目前正在寻找细胞外囊泡相关课题的朋友可以尝试从细胞外囊泡产生分选机制方面入手。这篇文章重点关注了内体起源的外泌体，并且发现IV型载脂蛋白E在脑中会影响外泌体的产生和释放，可能与阿尔兹海默病的发病存在病理上的联系。
- A Pretreatment-Free, Polymer-Based Platform Prepared by Molecular Imprinting and Post-Imprinting Modifications for Sensing Intact Exosomes. 一种基于聚合物的通过分子印迹和印记后修饰制备的外泌体检测平台，样品无需预处理即可用于完整外泌体的检测。 [Angew Chem Int Ed Engl] IF= 102 PMID：30511366
PS：文章设计了一种用于外泌体捕获和检测的平台。使用外泌体标志蛋白的抗体捕获用于芯片制备的模板外泌体，再制备与外泌体结合的检测单元，通过多聚物封闭为结合区域并锚定外泌体检测单元。最后去掉模板外泌体。构建完成检测芯片。这一款芯片在进行外泌体检测时不需要进行样品的前处理步骤，具有一定的便捷性。具体的原理和操作请大家参考原文。
- Laminin γ2-enriched extracellular vesicles of oral squamous cell carcinoma cells enhance in vitro lymphangiogenesis via intergrin α3-dependent uptake by lymphatic endothelial cells. 口腔鳞状细胞癌细胞富含层粘连蛋白γ2的细胞外囊泡通过淋巴管内皮细胞的整合素α3依赖性摄取增强体外淋巴管生成。 [Int J Cancer] IF= 36 PMID：30485433
摘要：口腔鳞状细胞癌（OSCC）LN1-1细胞除了具有增强淋巴管内皮细胞（LECs）的迁移和管形成的能力之外，与其亲本OEC-M1细胞相比，之前显示出更强的淋巴管生成和淋巴结转移能力。通过一系列差异离心纯化并使用电子显微镜，动态光散射和蛋白质印迹进行表征的LN1-1细胞衍生的细胞外囊泡（LN1-1 EV）显示出促进LEC迁移，管形成能力，以及LEC更高的摄取效率。在基于细胞培养/液相色谱 - 串联质谱的蛋白质组学平台中使用氨基酸稳定同位素标记，层粘连蛋白-332蛋白，包括层粘连蛋白α3，β3和γ2，被验证为LN1-1 EV中的高表达蛋白。临床上，在患有淋巴结转移的OSCC患者的血浆EV中检测到更高水平的层粘连蛋白-332，表明EV携带的层粘连蛋白-332可以作为新的和非侵入性的生物标志物。层粘连蛋白γ2的敲低和抗层粘连蛋白-332中和抗体的抑制损害了LN1-1 EV介导的LEC迁移，管形成和LEC的摄取。重要的是，与对照EV相比，层粘连蛋白γ2缺陷型EV显示出进入淋巴结能力的降低。另外，层粘连蛋白332 /γ2介导的EV摄取依赖于整联蛋白α3而不依赖于β1，β4或α6。总的来说，LECs对富含层粘连蛋白γ2的EV的摄取增强了体外淋巴管生成，因此EV携带的层粘连蛋白-332是OSCC的可行生物诊断标志物。
PS：文章发现层粘连蛋白γ2在口腔鳞状细胞癌细胞来源的细胞外囊泡中上调会促进淋巴转移及体外淋巴管形成。比较中规中矩的报道，文章通过细胞外囊泡蛋白的质谱检测分析鉴定到了层粘连蛋白γ2的上调，这对于从事细胞外囊泡相关蛋白研究的朋友们是一个值得借鉴和学习的文章，可以参考这篇文章进行蛋白质谱的检测和目标蛋白的筛选。
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