本周的周总结会在周日准时发送给大家。journal of extracellular vesicle发布新版本的《指导要求》，也就是《MISEV 2018》。这一版的内容要相对2014年的更多更复杂。Hzangs会隔三差五的解读一些重要内容。希望对大家有所帮助。 今天给大家推送第五期。阅读和翻译一个非英语母语的人写的东西，简直要人命啊…… 先提一个很重要的点，想发好一点的文章，建议大家至少在做关键的功能验证实验时，要使用诸如密度梯度离心等可以获得高纯度细胞外囊泡的方法来纯化囊泡然后用于功能研究。这也是MISEV2018中所提到的，详细内容参加下文。
以下内容均来自《MISEV 2018》，hzangs的评论会特别注明。
细胞外囊泡的功能研究
MISEV2018相较于之前2014版本提出了一些新的要求。这些要求主要目的在于提高细胞外囊泡功能研究的准确性。避免对结果的过度解读造成研究者对实验结果认识上的偏差。首先，2014版提出了需要通过剂量梯度来反映功能是否依赖于细胞外囊泡。（例如，加2万个囊泡比加入1万个囊泡对细胞的诱导凋亡能力更强。Hzangs注）。在2018版本中，进一步提出了应当增加更多的对照，在对细胞外囊泡进行功能研究时需要设置诸如完全条件培养基、去除细胞外囊泡的条件培养基等。同时需要考虑是否有细胞外囊泡共分离的成分对研究的功能发挥了作用。其次，需要设置严格的阴性对照，例如针对条件培养液应当使用对应的未与细胞共培养但是经过了其他相同处理的培养液作为一个阴性对照；对于体液来说则需要选取与功能相关的阴性对照，如正常人或者未经特定处理的体液等。再次，至少需要通过高纯度的分离方法如梯度密度离心等获得高纯度细胞外囊泡来证明功能与细胞外囊泡紧密相关，尽可能排除其他非细胞外囊泡成分在功能分析中带来的假阳性。最后，需要通过研究去除EV后的成分对功能的影响，以证明功能变化与EV的存在呈现紧密联系。The refined separation must be performed at least for a set of biological replicates, but not necessarily systematically afterwards. 这是MISEV2018版中的原话，hzangs将它拷贝过来，以做说明。这句话的要求是：对于功能试验，至少有一些关键性的，用于证明功能与EV紧密相连的实验需要使用高纯度细胞外囊泡。对于研究中的其他步骤，并不做严格要求。（也就是说，如果你说细胞A来源的EV能够诱导细胞B凋亡，那你至少要有一个实验是通过诸如密度梯度离心等高纯度EV纯化方法提取了A细胞来源的高纯度的细胞外囊泡，加到B细胞中，B细胞凋亡增加了。 Hzangs注）
确定不同细胞外囊泡亚群与功能的关系。
需要明确的一点，在分析单一类型EV的功能时（例如，在不同研究中称为ectosomes，microvesicles或microarticle的小型EV或大型EV），可能会错过对功能影响最大的其他EV亚群类型。例如，即使在小型EV制剂中发现其对功能的影响，这一影响也可能存在（甚至可能更集中）于已经消除的其他EV亚型。将大EV（例如“微泡”）对功能的影响与小EV对功能的影响进行比较应该是所有功能研究的第一步。此外，当在EV中发现的功能可能是与EV特异性结合或共分离的可溶性分子时，必须考虑EV样品的相关功能仅是样品中非EV组分的可溶性蛋白部分功能的可能性（例如，当你说外泌体可以带着wnt分子去影响发育的时候，可能审稿人就要问，这个wnt到底是外泌体结合的还是仅仅在分离外泌体时与外泌体共分离了。Hzangs注）。定量地比较EV功能作用强度，EV耗尽后的功能作用强度以及未纯化EV的初始液体功能作用强度可以确定主要是那些成分在发挥作用。理想情况下，从任何来源（生物流体，条件培养基......）中回收的细胞外囊泡的所有功能研究都可以从大类细胞外囊泡的粗略分离开始（例如大型与小型细胞外囊泡相对于EV耗尽部分进行功能作用对比）。重要的是，为了将功能归因于不同类别的EV，应对每个组分的功能作用进行横向的并排对比。对于希望分析特性一种亚型EV的作者可以通过提出特定实验目的特异性选择该亚型的实际或理论原因来证明该选择的合理性，并进一步进行功能分析。在进行功能测试前，建议先确定根据总蛋白、粒子数和核酸成分等确定ev是否在不同的组分中存在。如果这些EV相关组分中没有一个是可检测的，一旦初步实验显示对功能无影响，则可以在进一步的功能测试不再加入这些组分作为阴性对照。另外，在分离EV的生物流体的产生条件的任何变化（即，不同的培养条件或细胞的处理，生物流体的不同类型的患者）之后应当重新分析所有EV类别和不同组分。（就是说，你要确定不同亚群的EV是否对特定的功能都有作用，另外也要研究其他非EV组分是否对功能有贡献。 Hzangs注）
一个示例：通过差速离心分离后比较不同亚群EV及其他组分的功能活性（ref：220）.从给定体积的培液开始。首先几次低速离心，上清a转移至新管中。上清a中速离心一次得到上清b及大细胞外囊泡如凋亡小体等。上清b告诉离心得到上清c及小细胞外囊泡如外泌体等。上清c可作为EV耗尽后的阴性对照，其余沉淀通过PBS重悬后再次以各自原有的离心速度离心沉淀，作为不同EV亚群样品用于功能研究。
在功能研究中如何对同实验组中的EV进行归一化处理（也就是我们经常讨论的内参、外参问题，hzangs注）
定量比较不同细胞外囊泡的功能的最合适的归一化策略将取决于科学问题。可以选择通过EV的特征，或通过源材料的数量，或通过共同分离的标准来归一化。分离的EV的特征包括颗粒计数，EV样品中生物分子类型的总量（例如蛋白质，核酸或脂质），以及特定EV相关分子的含量或活性。源特征包括获得EV的基质的量（生物流体的初始体积，组织的初始质量，分泌细胞的初始数量等）（这里是说内参可以如何选择，hzangs注）。共分离标准品是在分离前添加到基质中的可追踪材料[202]（这里是说，可以选用外参）。可以追求多种标准化策略[120]，并且如其他地方所强调的，无论标准化方法如何，都推荐研究中加入剂量依赖性反应分析。前还没有明确的最佳归一化方法。因此，研究者必须在文章中报告和证明标准化的选择，并应提供替相关细节。例如，当研究从一些生物流体获得的EV时（如血液衍生物），按体积标准化可能是合适的。对于其他液体，如灌洗液和尿液，供体之间不容易比较初始体积，因此另一种策略可能更合适。作为另一个例子，对于体外研究，通过EV组分（蛋白质，脂质，RNA）或颗粒数的水平进行标准化可能是合适的，但研究者选用的归一化方法应当符合基本实验逻辑（符合实验逻辑很重要！比如尿液等样本，你不能拿着体积去做内参，因为不同病人来源的尿液因为水分的多少而严重影响囊泡的浓度。你再拿体积做内参，就是不符合逻辑了！hzangs注）。可能的情况下，还应提供关于分泌细胞数量的信息。记录和报告。（这里可以看到，基本上内参的选择可以是特定的蛋白、核酸或脂质组分，也可以是诸如体积、粒子数等物理参数；外参的选择则可以根据需要进行自行添加。Hzangs注）
证明在没有直接细胞 - 细胞接触的情况下观察到活性
从理论上讲，像可溶性细胞因子依赖性功能那样，细胞外囊泡相关的功能应该在两个彼此不直接接触的细胞之间观察到。因此，EV功能验证应当通过，如transwell共培养系统或更复杂的基于微流体的培养装置进行EV-供体和EV-受体细胞在体外远距离培养，或通过将受体细胞与供体细胞条件培养的培养基一起培养等进行。然而，就EV-供体和 -受体细胞的相应数量而言，这些共培养条件未必与生理条件具有高度相关性。如果这样的测定产生阳性结果，它们证明信号的转移以细胞接触非依赖性方式发生，在这种情况下，下一个必要步骤是区分该功能是EV还是可溶性组分的作用。在这一步骤缺乏阳性结果表明细胞 - 细胞接触是信号交换所必需的，但它仍然可以通过转移质膜衍生的囊泡（如细胞吞噬作用）或局部交换膜封闭机构来传递信号。因此，阴性结果表明不存在远距离信号作用，但并未并不表明EV没有参与这一功能作用。（要注意哦。这里已经说明，EV在一些近距离相互作用中也可能发挥作用。因此远距离作用分析是阴性结果，与EV参与功能调控并不矛盾。Hzangs注）
好啦，今天这一次的解读就先到这里。回顾一下，这一期MISEV2018解读主要介绍的是细胞外囊泡功能分析中需要注意的一些事项，同时也简介了一些细胞外囊泡功能分析中实验设计的案例。这对大家在实验中如何严谨的设计实验，通过严谨的实验证明自己的假设和猜想具有十分重要的指导意义，因此推荐大家好好了解一下这一部分的内容。另外值得注意的一点，MISEV2018对功能验证的要求更高了，在大家研究EV功能的时候还是至少需要有一两个关键实验使用高纯度细胞外囊泡分离方法如梯度密度离心等进行。这样做可以是文章更具说服力。另外，注意在自己论文写作的时候避开一些容易被审稿人质疑的点。提前躲避大坑要比审稿时填坑容易的多！
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外泌体资讯网 【新手福利】MISEV2018解读（五）
