作者：企鹅
人们对外泌体的诊断和治疗潜力越来越感兴趣，但是对这些细胞外囊泡的确切描述仍然是未知的。针对这个问题，来自美国范德堡大学医学中心的Robert J. Coffey课题组在近期的Cell杂志上发表文章，根据严格的分离方法对外泌体进行了重新评估，挑战了这些细胞间通信载体的一些公认特性。
细胞释放不同大小、不同细胞内起源的胞外小泡（EVs）。EVs的异质性和非囊泡性细胞外纳米颗粒的存在对我们理解不同分泌成分的组成和功能特性构成了主要障碍。更精确地了解RNA、DNA和蛋白质所在的正确细胞外组分，并确定它们的分泌机制，对于识别生物标志物和设计未来的药物干预至关重要。
外泌体是由内体衍生的40-150纳米的小细胞外囊泡(sEVs)，由大多数细胞分泌。RNA（包括mRNA、microRNA [miRNA]和其他非编码RNA）、DNA和脂质被报道积极和选择性地整合到腔内小泡(ILVs)中，这些小泡位于多泡内体(MVEs)中，是外泌体的前体。除了形成外泌体中膜蛋白的组分，内体膜的向内出芽被认为会导致胞质蛋白和其他成分被吞噬到ILVs的腔内的机制。MVEs与质膜融合后，将ILVs作为外泌体释放到细胞外空间。相比之下，微泡是由质膜脱落产生的150-1000 nm的大细胞外膜泡（lEVs）。然而，至今仍然缺乏区分微泡和外泌体的特异性标记物。
最近人们对EVs的兴趣越来越大，主要是由于发现外泌体在分泌的细胞外RNA (exRNA)的转运中起作用，包括细胞外miRNA和mRNA转运。Argonautes (Agos)是重要的miRNA加工蛋白，外泌体介导Ago蛋白分泌仍是一个悬而未决的问题。其他RNA结合蛋白(RBPs)也被报道存在于外泌体中，可能具有RNA分选的作用。然而，细胞外囊泡和纳米颗粒的异质性，以及纯化策略的差异，使当前外泌体的分析变得混乱。
来自范德堡大学的研究人员近期在Cell杂志上发表文章，对外泌体组成进行了重新评估，确定了蛋白质、RNA和DNA在小细胞外囊泡和非囊泡细胞外物质之间的差异分布，并确定小细胞外囊泡不是活跃的DNA释放载体。
传统外泌体分离方法和该研究改善的外泌体分离方法的对比。
(A) 传统的外泌体分离方法产生了富含外泌体且无大细胞外囊泡(lEVs)的囊泡和非囊泡的混合物。
(B) 该报道改善的外泌体分离方法采用两步法，首先使用高分辨率密度梯度离心从小细胞外囊泡(sEVs)中分离出非囊泡部分，然后通过直接免疫亲和捕获(DIC)从非外泌体sEVs中分离出真正的经典外泌体。经典外泌体由四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的表达标记，而非外泌体sEVs由annexins A1和A2标记。
该研究采用高分辨率密度梯度分离技术将sEVs从非囊泡性颗粒中分离出来，并采用直接免疫亲和捕获技术（direct immunoaffinity capture, DIC）将外泌体从其他类型的sEVs中分离出来。DIC在无超离的情况下，以经典的外泌体四次跨膜蛋白为靶点，采用捕获珠进行分离。蛋白质组学和核酸分析表明，细胞外RNA和蛋白质在sEVs和非囊泡组分中有不同的表达。包括Ago1-4在内的许多与外泌体装载exRNA相关的RBPs与带有外泌体标记蛋白CD63、CD81和CD9的经典外泌体无关。外泌体缺乏细胞骨架元素和常见的糖酵解酶；这些高度丰富的胞质蛋白的缺乏表明外泌体的装载一定是一个高度调控的过程。这些研究是使用人类结肠癌(DKO-1)和胶质母细胞瘤(Gli36)癌细胞系进行的。这一主要发现在正常人类肾上皮细胞和血浆中得到了证实。
DKO-1细胞分泌的大细胞外囊泡（lEV）、小细胞外囊泡（sEV）和非囊泡组分的电镜图
人们一直认为外泌体是细胞外DNA分泌的载体，使它们成为癌症患者液体活检的诱人目标。该研究提供的证据表明，双链DNA (dsDNA)和DNA结合组蛋白不存在于外泌体或任何其他类型的sEV中。相反，该研究证明细胞外dsDNA和组蛋白的活跃分泌是通过自噬和MVE依赖的机制发生的，而不依赖于外泌体。此外，该研究确定annexin A1是经典质膜形成的微泡的一个标志蛋白。这些发现更精确地阐明了外泌体成分，为探索其功能特性提供了更坚实的基础。
细胞外dsDNA和组蛋白的分泌不依赖于外泌体和小细胞外囊泡
该研究表明，真正的外泌体在生物分子成分方面的范围要比人们普遍接受的小得多。虽然外泌体的分类标准本质上不是非常的精准的，但科学命名法的精确性对于确保实验观察之间的一致性至关重要。正确地将功能定位到适当的细胞外实体将是其作为生物标志物或治疗手段成功应用的必要条件。
参考文献：
Jeppesen DK, Fenix AM, Franklin JL, Higginbotham JN, Zhang Q, Zimmerman LJ, Liebler DC, Ping J, Liu Q, Evans R, Fissell WH, Patton JG, Rome LH, Burnette DT, Coffey RJ. Reassessment of Exosome Composition. Cell. 2019 Apr 4;177(2):428-445.e18. doi: 10.1016/j.cell.2019.02.029.
Pluchino S, Smith JA. Explicating Exosomes: Reclassifying the Rising Stars of Intercellular Communication. Cell. 2019 Apr 4;177(2):225-227. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.020.
外泌体资讯网 Cell重磅：外泌体组成的重新评估
