越来越多的研究显示，外泌体（EXs）可以用于装载microRNA（miRNA）的细胞与细胞间通信的天然纳米级载体，并且是体液中miRNA生物标志物的理想来源。目前的方法可以批量分析EXs的miRNA含量，但是这些方法并不适合外泌体miRNA的原位化学计量，并且不能揭示单囊泡水平的表型异质性。
在近日发表于Theranostics杂志（IF 8.063）的一篇文章中，来自香港浸会大学化学系李红荣（Hung-Wing Li）课题组的研究人员开发了一种基于全内反射荧光成像（total internal reflection fluorescence，TIRF）的单囊泡成像分析方法，用于直接观察和定量血清微量样品中外泌体单囊泡及其miRNA含量。该测定使用无活性的分裂式DNA酶和荧光淬灭的底物共同包装至streptolysin O处理的纳米级外泌体中，产生靶向miRNA的催化裂解反应，可以放大荧光信号的读数。研究人员利用开发的TIRF成像分析，对血清外泌体hsa-miRNA-21（miR-21，一种常见的肿瘤miRNA生物标志物）进行原位定量和化学计量分析。
结果显示，血清外泌体miR-21的TIRF成像分析可以区分肿瘤患者和健康受试者，其性能优于传统的实时聚合酶链式反应（PCR）分析。血清中的外泌体miR-21水平也可用于监测肿瘤进展和对治疗的反应性。此外，通过将分子信标（molecular beacon，MB）探针递送到外泌体中，TIRF测定可以容易地在原位确定靶标外泌体miRNA含量的精确化学计量。
图：外泌体miRNA含量的TIRF成像测定和A375外泌体表征。（A）使用SDP原位分析外泌体miRNA的示意图。（B）使用TIRF成像的单囊泡荧光成像的示意图。在TIRF图像中，来自单个EX的荧光信号被可视化为单独的亮点。（C）分离的A375外泌体的TEM图像。（D）DLS检测到的SDP穿透前后A375 EXs的水动力直径。（E）SLO介导的荧光DNA探针包装至A375 外泌体中。
本研究开发了一种基于囊泡的温和、精确且通用的方法，用于外泌体miRNA的原位定量和化学计量分析。该TIRF成像平台表现出高适用性，可用作其他疾病相关的外泌体miRNA标记的单囊泡原位定量和化学计量分析的通用且有用的工具，并提供了对外泌体介导的miRNA通信的生理功能的新理解。
参考文献：He D, Wang H, Ho SL, Chan HN, Hai L, He X, Wang K, Li HW. (2019) Total internal reflection-based single-vesicle in situ quantitative and stoichiometric analysis of tumor-derived exosomal microRNAs for diagnosis and treatment monitoring. Theranostics 9(15):4494-4507.
