细胞外囊泡（EVs）越来越被认为是细胞间通讯的重要载体，并且是生物标记物发现的有希望的来源。由于蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTM）的状态（例如磷酸化和糖基化）可能是细胞生理学的关键决定因素，因此EVs中蛋白质PTM的全面表征对于早期诊断和疾病状态监测非常有价值。但是，由于纯化的EVs数量有限，PTM蛋白含量低以及生物流体中蛋白质和代谢产物的干扰，EVs中PTM的分析非常复杂。
最近，普渡大学陶纬国（W. Andy Tao）教授团队在Nature子刊Nature Protocols杂志（影响因子11.334）上发表文章，报道了一种从少量人体血浆中分离EVs中的磷酸化蛋白和糖蛋白的方法，从而鉴定出近10,000种独特的磷酸肽和1,500种独特的N-糖肽。
该方法证明了使用这些数据来识别潜在标志物以区分疾病与健康状态的可行性。该文提出了一种更新的工作流程，用于先后分离磷酸肽和N-糖肽，从而能够对同一临床样品进行多次PTM分析。这一更新的实验流程提高了EVs分离、蛋白质提取和磷酸肽/ N-糖肽富集的重现性和效率，从而实现了从1毫升血浆中分离的EVs中低丰度PTM的灵敏分析。工作流程的模块化也允许对磷酸肽或糖肽进行单独表征，并可以对总蛋白质组和其他感兴趣的PTM进行额外分析。采血后，该方案需要2天，包括EVs分离、PTM/肽富集、质谱分析和数据定量。
EVs磷酸化蛋白质组学和糖蛋白质组学分析实验流程。EVs的分离、磷酸肽和糖肽的富集以及nanoflow LC-MS分析的工作流程。通过连续高速和超高速离心从人血浆中分离微泡和外泌体。裂解EVs，并在SDC缓冲液中提取和消化蛋白质。依次富集磷酸肽和N-糖肽，然后进行LC-MS/MS分析。N：天冬酰胺；P：磷酸化；S：丝氨酸；T：苏氨酸。
实验步骤：
1.血浆准备 耗时40分钟
- 室温下，在K2EDTA采血管中以1300 g离心~2 mL新鲜血液（可得~1 mL血浆）离心10分钟，以去除血细胞、碎片和大的凋亡小体。收集上清液。
注意：从新鲜血液中获取1 mL血浆，起始的最佳体积为2 mL。根据作者的经验，这是处理后将产生可见沉淀物和用于PTM分析和定量的最佳产量的最少量血浆（1 mL）。 根据我们的经验，在消化之前，从1 mL血浆中可以得到20–100 µg蛋白质。视血浆、疾病和其他因素而定。对于一式三份，我们建议将初始血浆量（3 mL）增加三倍，以有足够的样品进行定量。
- 在室温下4,000 g离心上清液15分钟以去除血小板。收集上清液~1毫升。
注意：在血沉棕黄层上方留出30–50 µL血浆，避免产生污染。血浆样品可以在−80°C下保存长达1-2年。在使用前，在37°C水浴中融化血浆样品。
2.EVs纯化 耗时3–4小时
- 在4°C下20,000 g离心血浆样品1 h。（此步骤的沉淀用PBS重悬，再次20,000 g离心1 h可得MVs。）
- 收集上清液用于外泌体纯化，使用超速离心机在4°C下以100,000g离心。
- 除去上清液，并使用1 mL过滤的PBS洗涤沉淀。在4°C下再次以100,000g离心1小时。
- 除去上清液。沉淀包含外泌体。
注意：外泌体不如MV可见。确保在靠近沉淀物的地方小心吸（大部分时间大部分情况下是不可见的）。
3.EVs鉴定 耗时不定
一般采用WB检测外泌体标志性蛋白（例如CD9、CD63、CD81、α-actinin-4、CD40和mitofilin）；NTA检测的大小分布和浓度；大小和形状可以使用电子显微镜或原子力显微镜（AFM）检测。
4.EVs裂解、还原和烷基化 耗时10–20分钟
- 用100 µL EV裂解、还原和烷基化缓冲液重悬外泌体和MV，使其溶解。
- 溶解后，将样品在95°C加热5分钟。
- 加入400 µL胰蛋白酶缓冲液，将烷基化蛋白质稀释五倍。
- BCA检测蛋白质浓度
5.酶消化耗时16–18小时
- 在37°C下，以1：100（wt/wt）的酶/蛋白质比例用Lys-C消化20–100 µg样品3小时。 总体积应为500 μL。
- 以1:50（wt/wt）酶/蛋白质比例添加胰蛋白酶，并在37°C下孵育过夜。
- 以终浓度5％（vol/vol）添加TFA，酸化消化的肽，并向500 μL的消化溶液中添加500 μL乙酸乙酯。
- 将溶液Vortex 2分钟，然后在室温20,000 g离心2分钟，以获得水相和有机相。丢弃最上面的有机层。
- 重复步骤上面的乙酸乙酯离心2步，以除去尽可能多的洗涤剂残留物（添加乙酸乙酯，Vortex并丢弃顶部有机层；不要再次添加TFA）。收集水相并在真空离心机中干燥。
6.C18脱盐耗时1小时
7.磷酸肽富集耗时1–2小时
8.糖肽富集耗时~8小时
9.糖肽的StageTip脱盐耗时1小时
10.LC–MS/MS●耗时~1小时/检测
11.结果分析耗时>1天
连续/分别的磷酸肽和糖肽富集实验示意图
维恩图显示重复之间的磷酸肽和磷酸蛋白重叠以及单独的（separate）和先后连续的（sequential）工作流程之间的重叠
维恩图显示重复之间的糖肽和糖蛋白重叠以及单独的（separate）和先后连续的（sequential）工作流程之间的重叠
参考文献：
Hillary Andaluz Aguilar, Anton B. Iliuk, I-Hsuan Chen & W. Andy Tao. Sequential phosphoproteomics and N-glycoproteomics of plasma-derived extracellular vesicles. Nature Protocols 2019 Dec 20. doi: 10.1038/s41596-019-0260-5.
