活细胞下的外泌体成像报告标志物pHluorin-CD63可以动态监测细胞迁移、扩散和外泌体的分泌。但是存在荧光微弱和无法稳定表达，限制了该标志物的使用。近日，美国范德堡大学医学院的研究人员在pHluorin中引入了稳定的M153R突变，突变后的pHluorin-CD63表现为更高、更稳定的表达，并能更好地监测外泌体分泌，可能会成为了解外泌体自分泌和旁分泌作用的有用工具。该研究发表于Nature Communications杂志上。细胞外囊泡（EVs）是从细胞中释放出来的纳米级囊泡，具有强大的自分泌和旁分泌生物学活性。尽管EV最初被认为是不具有生物学相关性的细胞碎片，但现在EV已被认为构成了一种细胞间通信的基本模式，可在各种情况下介导特定蛋白质、核酸和脂质转运到受体细胞中。因此，EV参与多种疾病的发病机理，包括感染、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等。细胞外囊泡可以通过其大小、生物发生机理、内容货物和密度来分类。小EV（包括外泌体）和大EV（如脱落的微囊泡MVs和大的oncosomes）。外泌体是直径为50-150 nm的小EV的一种，关于外泌体参与EV功能的研究最多。外泌体在称为多囊体（MVBs）晚期的内体细胞器中形成为腔内囊泡（ILV），并在MVB与质膜融合后分泌到细胞外。目前已经提出了几种外泌体的生物发生过程，包括通过转运必需内体分选复合物系统（ESCRT）捕获被泛素化的货物。比如，Syndecan和syntenin复合物可以通过ESCRT辅助蛋白Alix调节外泌体的生物发生。此外还存在着不依赖于ESCRT的外泌体生物发生机制，该机制涉及中性鞘磷脂酶2（nSMase2）产生的神经酰胺诱导的细胞膜弯曲。四次跨膜蛋白（例如CD9、CD63和CD81）是外泌体和其他小EV的常用标记物，可能与ILV货物选择或生物发生有关。CD63是四次跨膜蛋白超家族的成员，在晚期胞内MVB中的ILV高度富集，并且是广泛使用的经典外泌体标记物。CRISPR / Cas9敲除CD63的表达会减少小EV的分泌，但不会影响大EV的分泌，表明CD63有助于外泌体的生物发生。在许多研究中，CD63已被用于标记和追踪外泌体和MVB。但是，大多数以前的研究都使用了对pH不敏感的荧光蛋白，例如GFP或RFP，可以看到胞内体内部的极亮荧光。由于较差的信噪比，这种明亮的内部荧光限制了观察MVB与质膜融合的过程。为了解决这个问题，研究人员采用了突触囊泡领域的一种方法，该方法利用了pH敏感的GFP衍生物pHluorin来观察动态囊泡融合过程。pHluorin在酸性条件下实际上是无荧光的，但在中性pH时发出荧光，因此使其成为观察酸性晚期胞内MVB与质膜融合的理想报告分子。由于细胞外部环境处于中性pH，因此在融合过程中会发生酸到中性的转换。研究人员在此之前开发了用pHluorin标记的CD63报告基因来追踪外泌体的分泌，并用pHluorin-CD63来证明MVB融合比扩散细胞中的黏附形成要早1-2 min。研究人员还观察到了pHluorin-CD63阳性粘附痕迹留在迁移细胞的后面。此后，有其他研究也报道了pHluorin-CD63被用于研究G蛋白偶联受体信号传导对外泌体分泌的调节。pHluorin-CD63是追踪外泌体分泌和MVB与质膜融合的有力工具。但是，尽管此构建体可用于具有高分辨率成像的二维（2D）组织培养条件下使用，但一部分pHluorin在细胞中易于降解，从而导致低水平的表达和快速的光漂白。因此，研究人员发现pHluorin-CD63很难在细胞中稳定表达，这限制了其用于实时成像以选择条件。在这项研究中，研究人员通过掺入单氨基酸突变M153R改善了superecliptic pHluorin-CD63的稳定性和亮度，该突变先前已确定在细菌蛋白培养中帮助维持pHluorin比例的稳定。研究人员证明了突变的pHluorin-CD63，即pHluo_M153R-CD63，可以在细胞中表达为稳定的构建体，并且是外泌体分泌的信号分子。使用该构建体，研究人员能够轻松地可视化细胞外和细胞内囊泡，并观察细胞在2D和3D培养中沿着细胞外沉积的囊泡路径的迁移，即细胞的寻路行为。通过将其他对pH不敏感的红色荧光蛋白标记pHluo_M153R-CD63，研究人员还能够追踪外泌体生命周期的多个方面，包括融合前细胞内的MVB运动、胞外外泌体的摄入作用以及包含外泌体的内体酸化。图：双重表达pHluo-M153R-CD63（绿色）和mCherry-CaaX（红色）的HT1080细胞的2D、3D培养实时图像。参考文献：Sung BH, von Lersner A, GuerreroJ, Krystofiak ES, Inman D, PelletierR, Zijlstra A, Ponik SM, Alissa M. Weaver AM. (2020) A live cell reporter ofexosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.Nat Commun 11(2092).外泌体资讯网 Nature子刊：外泌体的活细胞荧光成像用于外泌体分泌和细胞迁移的可视化
