干细胞用于组织再生中存在免疫排斥和畸胎瘤形成等问题，但干细胞衍生的外泌体不会引起这些问题。来自美国俄克拉荷马大学毛传斌课题组和浙江大学杨明英课题组的研究人员利用诱导人间充质干细胞（hMSCs）成骨分化的外泌体，并用其修饰3D打印的钛合金支架以实现无细胞的骨再生过程。该研究发表于Advanced Science杂志上（IF=15.84）。
骨缺损由多种临床疾病引起，例如骨感染、骨肿瘤、骨骼异常、先天畸形、骨折、无血管坏死、萎缩性骨不连、骨质疏松和骨创伤。骨缺损传统治疗采用自体移植、同种异体移植治疗。然而，这些疗法有其自身的局限性。对于自体移植，受限于供体来源且与缺损部位匹配情况。而对于同种异体移植和异种移植，具有疾病传播和免疫排斥的风险。干细胞的植入，例如人间充质干细胞（hMSCs）和人脂肪干细胞，被视为替代策略。然而，干细胞的植入面临重大挑战，包括免疫排斥、畸胎瘤形成和无方向的细胞分化。在干细胞上植入3D支架可能会引起免疫排斥，引起畸胎瘤形成，并导致无方向的细胞分化。因此，在不使用外部种子干细胞的情况下进行骨再生（称为无细胞再生）是解决这些源自细胞的问题的有前途的方法。实际上，植入无细胞支架以促进无细胞骨组织再生已成为避免这些问题的一种有前途的策略。
为实现无细胞组织再生，无细胞3D支架应具有可诱导成骨的生化和物理性质。可能的生化线索之一是细胞分泌的外泌体，它们是纳米颗粒（30-200纳米），其脂质双层包裹信号分子，例如miRNA。源于干细胞的外泌体的免疫原性低于细胞本身，因为外泌体含有的膜蛋白（例如主要的组织相容性复合物MHC）较少。外泌体可以长时间保持其生物学活性。外泌体中的可溶性小分子，例如miRNA、生长因子、细胞因子和转录因子，受到脂质双层的保护，并可以释放到靶组织中。由于外泌体包含一系列遗传信息，如miRNA一样，可以指导免疫调节和细胞间通讯。外泌体从细胞释放时，可以通过粘附在受体细胞表面与受体细胞发生相互作用，并通过脂质配体受体相互作用、内吞摄入或与细胞膜融合而进行通讯。
由于MSC会将外泌体分泌到培养基中，因此MSC条件培养基将含有外泌体。这可能可以解释已报道的发现，即使用MSC条件培养基也可以促进组织再生。例如，以MSC为条件的培养基可以缩小梗死面积以治疗心肌缺血，这种培养基可以增强肾源性上皮细胞的迁移和增殖，并增加肾小管细胞的体内存活率。静脉注射MSC衍生的外泌体可促进神经血管重塑。这些发现表明，包裹在外泌体中的生化物质也可能在体外和体内诱导成骨。
图：干细胞衍生的外泌体可进行无细胞下的骨组织再生
因此，在这项研究里，研究人员鉴定了hMSCs分泌的成骨外泌体，并使用外泌体修饰3D打印的钛合金支架（Ti支架）以实现无细胞的骨再生。具体而言，研究人员采用了在成骨分化培养基中预分化的hMSC衍生的外泌体，分别在0、4、10、15和20天（称为EXO-D0、EXO-D4、EXO-D10、EXO-D15和EXO-D20）鉴定可在体外诱导hMSC向成骨细胞分化的外泌体。然后用成骨外泌体填充无细胞的3D打印Ti支架，以实现无细胞的骨再生。Ti支架用于支撑外泌体，因为Ti具有生物相容性，不会引起与组织的免疫反应，并支持骨细胞和矿化的骨基质的附着而无任何介入。此外，Ti支架具有理想的性能，例如均匀的结构、高强度、低刚度、高孔隙率、耐腐蚀性和高摩擦系数。
研究人员使用实时PCR、免疫荧光染色、茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）活性来证实在hMSC衍生的外泌体诱导下hMSC的成骨作用。无细胞的3D Ti支架也被用于在体内诱导4和12周的骨组织再生。结果发现，外泌体（EXO-D10和EXO-D15）携带有诱导分化的miRNA（例如Hsa-miR-146a-5p、Hsa-miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p、Hsa-miR- 129‐5p、Hsa‐miR‐32‐5p、Hsa‐miR‐133a‐3p和Hsa‐miR‐204‐5p），因此可以在体外诱导hMSC的成骨分化，并使无细胞的Ti支架能够通过激活PI3K/Akt和MAPK信号通路在体内实现骨组织再生。因此，来自成骨细胞预分化hMSC的外泌体是无细胞骨组织再生的诱导剂。
